Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz
Summary
Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.
Abstract
In Reaktion auf zellulärem Stress oder Schädigung, proliferierenden Zellen kann ein spezifisches Programm induzieren, die einen Zustand der Langzeit-Zellzyklusarrest einleitet, zelluläre Seneszenz bezeichnet. Akkumulation von seneszenten Zellen erfolgt mit organismal Altern und durch kontinuierliche Kultivierung in vitro. Seneszenten Zellen beeinflussen zahlreiche biologische Prozesse, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Gewebereparatur und -regeneration, Tumorunterdrückung und Alterung. Kennzeichnend für seneszenten Zellen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal); p16 INK4A, p53, p21 und Ebene; höhere Niveaus von DNA-Schäden, einschließlich γ-H2AX; die Bildung der Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF); und der Erwerb eines Seneszenz-assoziierte Sekretorische Phenotype (PUSA), ein Phänomen, das durch die Sekretion einer Anzahl von pro-inflammatorischen Cytokinen und Signalmolekülen charakterisiert. Hier beschreiben wir Protokolle sowohl für replikativen undDNA Seneszenz in kultivierten Zellen-Schädigung induziert. Außerdem markieren Techniken, die wir den seneszenten Phänotyp mit mehreren Seneszenz-assoziierte Marker, einschließlich SA-β-gal, γ-H2AX und SAHF Färbung und zu quantifizieren Protein und mRNA-Spiegel von Zellzyklusregulatoren und SASP Faktoren zu überwachen. Diese Methoden können zur Beurteilung der Seneszenz in verschiedenen Modellen und Geweben angewandt werden.
Introduction
Mehr als vor einem halben Jahrhundert, Hayflick und Kollegen beschrieben , wie nicht – transformierten Zellen in Kultur vermehren, aber nur für einen begrenzten Zeitraum 1. Langzeitkultivierung von humanen Fibroblasten verursacht die Zellen vermehren zu stoppen; jedoch waren sie metabolisch aktiv, und wurde dieser zelluläre Seneszenz bezeichnet. Seneszenz können zur Hemmung der Tumorgenese von Vorteil sein, sie kann aber auch nachteilig sein, wie es angenommen wird , auf den Verlust der Regenerationsfähigkeit beizutragen , die mit dem Altern auftritt , 2, 3. Seneszenten Zellen wurden in Geweben akkumulieren gezeigt , wie Menschen im Alter von 4 und in einer Reihe von biologischen Prozessen, einschließlich der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Gewebereparatur und altersbedingte Entzündung 2 in Verbindung gebracht.
Kontinuierliche Passagierung der Zellen in Kultur induziert replikative Seneszenz, die in Verbindung gebracht wurdezu der Telomere Abrieb und genomische Instabilität. Verschiedene Zellspannungen, einschließlich DNA – Schädigung und Onkogenen, können auch Seneszenz 3 verursachen. Seneszenz verursacht durch andere Faktoren als Telomer Abrieb wird oft spannungsinduzierte oder vorzeitige Seneszenz bezeichnet und hängt im Allgemeinen von der p16 INK4A / Rb – Weg 5. Obwohl proliferierenden, typischerweise nicht – transformierten Zellen spindelförmig erscheinen, können seneszenten Zellen mit bestimmten Merkmalen identifiziert werden, einschließlich einer flache, große Morphologie und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase – Aktivität (SA-β-gal) (Abbildungen 1 und 2). Seneszenten Zellen akkumulieren auch DNA – Schädigung Marker, einschließlich γ-H2AX (Abbildung 3) 6, und möglicherweise Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF) (4) 7. Seneszenten Zellen höhere Zellzyklusregulatoren, einschließlich p 16 (p16 INK4A) und / oder p21 und p53 (Figur 5) 8, 9. Darüber hinaus haben jüngste Daten gezeigt , dass seneszenten Zellen nicht autonome Wirkungen durch eine Reihe von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen sezer die Seneszenz-assoziierte sekretorischen Phänotyp (SASP) 10 genannt haben. Obwohl dieses Phänomen SASP von Zelltyp zu Zelltyp, im allgemeinen unterschiedlich sein kann, ist es durch eine Erhöhung der Interleukin-6 (IL-6), IL-8, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) gezeigt, wachstums- regulierter Onkogen α (GRO-α) und GRO-β, unter anderem (Abbildung 6). Die besondere Beanspruchung oder Schäden , die Seneszenz induziert können auch Einfluss auf die sekretorischen Phänotyp 11, 12, 13. SASP kann durch Messung der Mengen an sezernierten Proteinen unter Verwendung von ELISAs oder Zytokin / Protein-Arrays detektiert werdens = "xref"> 10, 14. Obwohl posttranskriptionale Mechanismen können SASP Proteinspiegel 11 regulieren, 15, 16, 17, Veränderungen in der mRNA – Spiegel können auch in vielen Fällen nachgewiesen werden. Diese Änderungen sind in der Regel empfindlicher und leichter zu quantifizieren als Proteinebene Messungen. Andere seneszenten Marker können auch beurteilt werden, einschließlich DNA – Schädigung persistent Kern Foci, genannt DNA – Segmente mit Chromatin Veränderungen Verstärkungs Seneszenz (DNA-SCARS) 18, und verschiedene andere Marker 3, 19, 20.
Hier beschreiben wir gemeinsame Techniken für die Seneszenz in Zellen in Kultur zu induzieren und auch für mehrere Marker die Seneszenz zu messen, einschließlich SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, und das Protein und mRNA von alternNOA-assoziierte Moleküle.
Protocol
Representative Results
Discussion
unter Verwendung von humanen diploiden Fibroblasten Hier haben wir Methoden zur replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz beschrieben. Zusätzlich sind Techniken zum Protein- und mRNA-Mengen verschiedenen Seneszenz-assoziierte Proteine Quantifizieren enthalten sind, sowie Färbung für SA-β-gal und für den DNA-Schädigung Marker γ-H2AX. Diese Protokolle können weit seneszenten Phänotypen verwendet werden , sowohl in vitro zu bewerten und in vivo, obwohl viele Einschränkungen bes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Institute on Aging. Die Autoren möchten Myriam Gorospe und Kotb Abdelmohsen für viele hilfreiche Diskussionen über die Seneszenz und Kotb Abdelmohsen für auch kritisch Lesen des Manuskripts. Wir danken auch unser Labor Mitglieder, vor allem Douglas Dluzen für kritisch, das Manuskript zu lesen.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
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