तकनीक प्रेरित और यों सेलुलर बुढ़ापा को
Summary
सेलुलर बुढ़ापा, सेल चक्र गिरफ्तारी के अपरिवर्तनीय राज्य, विभिन्न सेलुलर तनाव द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। यहाँ, हम सेलुलर बुढ़ापा और तरीकों के लिए प्रेरित करने बुढ़ापा के मार्करों आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन।
Abstract
कोशिकीय तनाव या क्षति के जवाब में, proliferating कोशिकाओं एक विशिष्ट कार्यक्रम है कि लंबी अवधि के सेल चक्र गिरफ्तारी के एक राज्य शुरुआत करता है, सेलुलर बुढ़ापा करार दिया पैदा कर सकते हैं। वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का संचय जीवधारी उम्र बढ़ने के साथ और इन विट्रो में नित्य संवर्धन के माध्यम से होता है। वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं भ्रूण के विकास, ऊतक की मरम्मत और उत्थान, ट्यूमर दमन, और उम्र बढ़ने सहित कई जैविक प्रक्रियाओं, प्रभावित करते हैं। वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की पहचान शामिल है, लेकिन वृद्धि हुई बुढ़ापा जुड़े β-galactosidase गतिविधि (SA-β-गल) सीमित नहीं हैं; p16 INK4A, p53, और p21 के स्तर; डीएनए की क्षति के उच्च स्तर, γ-H2AX सहित; बुढ़ापा जुड़े हेट्रोक्रोमैटिन Foci (SAHF) के गठन; और एक बुढ़ापा जुड़े स्रावी phenotype (SASP), एक घटना समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और संकेत अणुओं के एक नंबर के स्राव की विशेषता के अधिग्रहण। यहाँ, हम दोनों replicative के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन औरसंवर्धित कोशिकाओं में डीएनए की क्षति प्रेरित बुढ़ापा। इसके अलावा, हम SA-β-गल, γ-H2AX और SAHF धुंधला सहित कई बुढ़ापा जुड़े मार्करों, का उपयोग करते हुए वृद्ध होनेवाला फेनोटाइप नजर रखने के लिए, और कोशिका चक्र नियामकों और SASP कारकों में से प्रोटीन और mRNA के स्तर अंदाजा लगाना तकनीक पर प्रकाश डाला। इन विधियों विभिन्न मॉडल और ऊतकों में बुढ़ापा के आकलन के लिए आवेदन किया जा सकता है।
Introduction
आधे से अधिक एक सदी पहले, हेफिलिक और उनके सहयोगियों ने बताया कि किस तरह untransformed कोशिकाओं संस्कृति में पैदा करना है, लेकिन केवल समय 1 की एक निश्चित अवधि के लिए। मानव fibroblasts के लंबे समय तक संवर्धन कोशिकाओं proliferating बंद करने के लिए कारण होता है; तथापि, वे पाचन सक्रिय थे, और इस सेलुलर बुढ़ापा बुलाया गया था। बुढ़ापा tumorigenesis बाधा के लिए फायदेमंद हो सकता है, लेकिन यह भी, हानिकारक हो सकता है के रूप में यह है कि उम्र बढ़ने के 2, 3 के साथ होता है पुनर्योजी क्षमता के नुकसान के लिए योगदान माना जाता है। वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं ऊतकों में जमा करने के लिए के रूप में 4 साल की उम्र मनुष्य और भ्रूण के विकास, घाव भरने, ऊतक की मरम्मत, और उम्र से संबंधित सूजन 2 सहित जैविक प्रक्रियाओं, की संख्या में फंसाया गया है दिखाया गया है।
संस्कृति में कोशिकाओं के नित्य passaging replicative बुढ़ापा, जो जोड़ा गया है लाती हैउदासीनता और जीनोमिक अस्थिरता टेलोमेर करने के लिए। डीएनए की क्षति और ओंकोजींस सहित विभिन्न सेल तनाव,, भी बुढ़ापा 3 हो सकता है। टेलोमेर उदासीनता के अलावा अन्य कारकों की वजह से बुढ़ापा अक्सर तनाव प्रेरित या समय से पहले बुढ़ापा कहा जाता है और आम तौर पर p16 INK4A / Rb मार्ग 5 पर निर्भर करता है। हालांकि proliferating, untransformed कोशिकाओं आम तौर पर आकार में धुरी दिखाई देते हैं, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं कुछ विशेषताओं वाले, एक फ्लैट, बड़े आकृति विज्ञान और वृद्धि की बुढ़ापा जुड़े β-galactosidase गतिविधि (SA-β-गल) (आंकड़े 1 और 2) सहित के रूप में पहचाना जा सकता है। वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं में भी डीएनए की क्षति मार्करों जमा, γ-H2AX (चित्रा 3) 6, और, संभावित, बुढ़ापा जुड़े हेट्रोक्रोमैटिन फोकी (SAHF) (चित्रा 4) 7 सहित। वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं कोशिका चक्र नियामकों के उच्च स्तर, पी सहित 16 (p16 INK4A) और / या p21 और p53 (चित्रा 5) 8, 9। इसके अलावा, हाल ही के डेटा से पता चला है वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं पूर्व-शोथ साइटोकिन्स और chemokines के एक नंबर के स्राव द्वारा गैर स्वायत्त प्रभाव हो सकता है कि बुढ़ापा जुड़े स्रावी phenotype (SASP) 10 कहा जाता है। हालांकि इस SASP घटना कोशिका प्रकार से कोशिका प्रकार के लिए भिन्न हो सकते हैं, सामान्य रूप में, यह इंटरल्युकिन 6 (आईएल -6), आईएल -8, granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), growth- में वृद्धि से प्रदर्शित किया गया है विनियमित ओंकोजीन α (GRO-α), और GRO-β, दूसरों के बीच (चित्रा 6)। विशेष रूप से तनाव या नुकसान है कि बुढ़ापा लाती भी स्रावी फेनोटाइप 11, 12, 13 को प्रभावित कर सकते। SASP ELISAs या साइटोकाइन / प्रोटीन सरणियों का उपयोग कर स्रावित प्रोटीन के स्तर को मापने के द्वारा पता लगाया जा सकतारों = "xref"> 10, 14। हालांकि बाद ट्रांस्क्रिप्शनल तंत्र SASP प्रोटीन के स्तर 11, नियमित कर सकते हैं 15, 16, 17, mRNA स्तर में परिवर्तन भी कई मामलों में पता लगाया जा सकता। इन परिवर्तनों को आम तौर पर और अधिक संवेदनशील और प्रोटीन के स्तर का मापन से अंदाजा लगाना आसान होता है। अन्य वृद्ध होनेवाला मार्कर भी लगातार डीएनए की क्षति परमाणु फोकी, बुढ़ापा (डीएनए निशान) 18 मजबूत क्रोमेटिन परिवर्तन के साथ डीएनए सेगमेंट नामक और विभिन्न अन्य मार्करों 3, 19, 20 सहित, मूल्यांकन किया जा सकता।
यहाँ, हम SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF सहित बुढ़ापा के कई मार्करों, को मापने के लिए संस्कृति में कोशिकाओं में बुढ़ापा उत्प्रेरण और यह भी के लिए आम तकनीकों का वर्णन है, और प्रोटीन और senesce के mRNAnce जुड़े अणुओं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम मानव द्विगुणित fibroblasts का उपयोग कर replicative और डीएनए क्षति प्रेरित बुढ़ापा के लिए तरीके का वर्णन किया है। इसके अलावा, प्रोटीन और विभिन्न बुढ़ापा जुड़े प्रोटीन की mRNA का स्तर मात्र निर्धारण के लिए तकनीक …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम, उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों बुढ़ापा और भी गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए Kotb Abdelmohsen के बारे में कई उपयोगी विचार विमर्श के लिए मिरियम गोरोस्प और Kotb Abdelmohsen का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम यह भी गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए विशेष रूप से डगलस डलूज़ेन, हमारे प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद।
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
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