기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기
Summary
세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세포 스트레스 또는 손상에 대한 응답으로 증식하는 세포는 세포 노화이라고 장기 세포주기 정지의 상태를 개시하는 특정 프로그램을 유도 할 수 있습니다. 노화 세포의 축적은 생명체의 노화와 체외에서 계속 배양을 통해 발생합니다. 노화 세포는 배아 발달, 조직 복구 및 재생, 종양 억제, 노화 등 많은 생물학적 과정을, 영향을 미친다. 노화 세포의 특징을 포함하지만, 증가 된 노화 – 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을)에 한정되지 않는다; P16의 INK4A, p53의, 그리고 P21 수준; γ-H2AX을 포함하여 DNA 손상의 높은 수준; 노화 관련 이질 병소 (SAHF)의 형성; 및 노화 관련 분비 표현형 (SASP), 염증성 사이토 카인 시그널링 분자의 수 분비를 특징으로하는 현상 획득. 여기, 우리가 모두 복제 성을위한 프로토콜을 설명하고DNA의 배양 세포에 노화를 유발 손상. 또, SA-β-gal을, γ-H2AX 및 SAHF 얼룩 등 여러 노화 – 관련 마커를 이용한 노화의 표현형을 모니터링하고, 세포주기 조절제 및 SASP 인자 단백질의 mRNA 수준을 정량화하는 방법을 강조. 이 방법은 다양한 모델과 조직에서 노화의 평가에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
반 세기 이상 전 헤이 플릭와 동료들은 문화 확산 방법 변형되지 않은 세포를 설명하지만, 시간이 1 만 한정된 기간 동안. 인간의 섬유 아 세포의 장기 배양이 확산 막을 수있는 세포를 발생; 그러나, 그들은 대사 활동했고, 이것은 세포 노화라고했다. 노화 종양 억제에 도움이 될 수 있지만,이 에이징 (2, 3)에 발생하는 회생 용량의 감소에 기여하는 것으로 생각된다으로도 불리 할 수있다. 노화 세포는 4 세를 인간과 배아 발달, 상처 치료, 조직 복구 및 나이와 관련된 염증이 포함 생물학적 과정의 숫자에 연루되어있다으로 조직에 축적하는 것으로 나타났다.
문화에 세포의 지속적인 계대이 연결되었습니다 복제 성 노화를 유도마찰과 게놈의 불안정성을 텔로미어합니다. DNA 손상과 암 유전자를 포함한 다양한 세포 스트레스는 또한 노화 3가 발생할 수 있습니다. 텔로미어 (telomere)의 감소가 아닌 다른 요인에 의한 노화는 종종 스트레스 유발 또는 조기 노화라고 일반적으로 P16의 INK4A / Rb는 경로 (5)에 따라 결정된다. 증식 있지만, 형질 전환되지 않은 세포는 일반적으로 형상 스핀들 표시, 노화 세포는 특정 특성을 갖는 평평하고 넓은 형태 증가 노화 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을) (도 1 및 2)를 포함하는 것으로 식별 될 수있다. 노화 세포는 γ-H2AX (도 3) (6), 및 잠재적으로 노화 관련 이질 병소 (SAHF) (도 4) (7)을 포함하여, DNA 손상 마커 축적된다. 노화 세포는 P를 포함하는 세포주기 규제의 높은 수준을 가지고 16 (P16의 INK4A) 및 / 또는 (P21) 및 p53의 (도 5) (8, 9). 또한, 최근의 데이터는 노화 세포는 염증성 사이토 카인 및 케모카인 중 다수를 분비하여 비 – 자율적 인 영향을 미칠 수있는 노화 – 관련 분비 표현형 (SASP) 10이라고 나타났다. 이 SASP 현상이 셀 타입에 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로는 인터류킨 -6 (IL-6), IL-8, 과립구 – 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 성장 -의 증가에 의해 증명된다 종양 유전자의 조절 α (GRO-α), 및 β-GRO, 그 중에서도 (도 6). 노화를 유도 특정 응력이나 손상도 분비 표현형 11, 12, 13에 영향을 미칠 수있다. SASP는 ELISA를 카인 / 단백질 어레이를 사용하는 분비 단백질의 수준을 측정함으로써 검출 될 수있다S = "외부 참조"> 10, 14. 전사 후 메커니즘 SASP 단백질 농도 11 조절할 수 있지만, 15, 16, 17 mRNA 수준의 변화 또한 많은 경우에 검출 될 수있다. 이러한 변화는 일반적으로 더 민감하고 단백질 수준 측정보다 정량화하기 쉽다. 기타 노화 마커는 영속 DNA 손상 병소 핵 노화 (DNA-SCARS) (18)을 보강 염색질 변형 불려 DNA 세그먼트, 및 다양한 다른 마커 3, 19, 20을 포함하여 평가할 수있다.
여기서는 SA-β-갈, γ-H2AX, SAHF 포함한 노화 여러 마커를 측정하는 또 배양 세포에서 노화를 유도하고 공통 기술을 설명하고 senesce의 단백질 및 mRNA를NCE 분자가 회합.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 인간의 배수체 섬유 아세포를 이용하여 복제 성 및 DNA 손상 – 유도 노화에 대한 방법을 설명 하였다. 또한, 다양한 단백질 및 노화 관련 단백질의 mRNA 수준을 정량화하기위한 기술이 포함될뿐만 아니라, 염색 SA-β-gal을위한 상기 DNA 손상 – 마커 γ-H2AX위한 것이다. 많은주의가 생체 (20)에 노화의 특성이 존재하지만,이 프로토콜은 널리 생체 외 및 <e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램, 노화에 국립 연구소에 의해 지원되었다. 저자는 또한 비판적 원고를 읽기위한 노화 및 Kotb Abdelmohsen에 대해 많은 도움이 토론 미리암 고로스페 및 Kotb Abdelmohsen을 감사드립니다. 우리는 또한 비판적 원고를 읽기 위해, 특히 더글러스 Dluzen 우리의 실험실 구성원 감사합니다.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
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