Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation
Summary
Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.
Abstract
CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.
Introduction
CD4 + T – Zellen sind von entscheidender Bedeutung orchestrators der adaptiven Immunantwort. Naive CD4 + T – Zellen sind in der Lage in mehr verschiedenen Effektor – T – Zellen entwickeln (zB Th1, Th2, Th17, etc.), das jeweils mit ihrem eigenen Satz von charakteristischen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren, abhängig von der lokalen Mikroumgebung 1. Die Linie Entscheidungen, die T-Zellen machen sind entscheidend für sowohl eine schützende Immunität und Toleranz gegenüber sich selbst. Th17 – Zellen sind eine Untergruppe von T – Zellen bekannt extrazellulären Bakterien und Pilze zu bekämpfen, aber ihre falschen Antworten werden ebenfalls in der Pathogenese von mehreren Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, wie Multiple Sklerose und Psoriasis , 2, 3 gebracht. Menschliche Zellen können Th17 4 , indem sie mit einer geeigneten Polarisations Umgebung von naiven CD4 + T – Zellen in vitro erzeugt werden. Vario wir Kombinationen der Zytokine IL-1β, IL-23, TGF-ß und IL-6 wurden für die Entwicklung der menschlichen Th17-Zellen verwendet. Th17 menschliche Zellen exprimieren CCR6, einen Chemokin – Rezeptor, der üblicherweise verwendet wird , diese Zellpopulation zu identifizieren und werden durch die Expression ihres Haupttranskriptionsfaktor, RORγt (kodiert durch RORC) 5, 6 definiert. Th17 Zellen haben die Fähigkeit, mehrere Cytokine zu exprimieren, aber IL-17A ist die Linie definierte Effektor Cytokin von diesen Zellen produziert. Wir untersuchten die Expression aller drei Th17-assoziierter Marker (CCR6, RORγt, IL-17A) , um die Robustheit des menschlichen Th17 in vitro Differenzierungsassay zu bewerten. Zusätzlich kultivierten wir humane CD4 + T – Zellen unter nicht-polarisierenden Bedingungen, in denen keine Zytokine oder blockierende Antikörper zu dem Kulturmedium hinzugefügt wurden als Negativkontrolle zu verwenden , da die Expression dieses Th17 Marker sollte sehr niedrig sein oder fehlen.
ve_content "> Eine Möglichkeit, normale menschliche T-Zell-Entwicklung und Biologie zu studieren ist die Genexpression während ihrer Entwicklung zu manipulieren. Short-interfering RNA (siRNA) synthetische kleine RNA-Moleküle sind, die Protein-kodierenden mRNAs Ziel und verwendet werden kann, spezifische Genexpression zu reduzieren MicroRNAs. (miRNAs) sind endogene nicht-kodierenden kleine RNAs bekannt Genexpression post-transkriptionell zu modulieren. miRNAs gezeigt wurde , sowohl in der murinen und humanen T – Zell – Biologie, einschließlich in Th17 Zellen 7, 8, 9 eine wichtige Rolle spielen. Es Hier ist entscheidend, zuverlässige Methoden der Manipulation von kleinen RNA-Aktivität in menschlichen T-Zellen zu haben, um ihre Auswirkungen auf die Genexpression und letztlich auf die menschliche T-Zell-Biologie zu studieren., beschreiben wir eine einfach zu bedienende, konsistente und zuverlässige Protokoll, das wir entwickelt für die Einführung kleine synthetische RNAs und locked nucleic acids (LNA, chemisch Nukleinsäuren mit erhöhter Stabilität modifiziert)Immunzellen in und speziell in der menschliche Th17-Zellen.Es gibt mehrere alternative Methoden der kleinen RNAs in Säugerzellen einzuführen, die in der Regel fallen chemische, biologische oder physikalische Kategorien 10. Üblicherweise verwendete chemische Verfahren, einschließlich lipidbasierten Transfektionen und Calciumphosphat-Transfektionen stützen sich chemisch-DNA-Komplexe zu schaffen, das effiziente up von Zellen aufgenommen werden. Im allgemeinen chemischen Methoden sind nicht so effizient für die Transfektion von primären T-Zellen. Die häufigste biologische Methode ist einen viralen Vektor (zB Retrovirus oder Lentivirus), zu verwenden , die direkt an fremde RNA in einen Wirt als Teil ihres natürlichen Replikationszyklus einfügt. Virale Transduktion dauert in der Regel länger, abgeschlossen vor allem, wenn man für die molekulare Klonierung von proviralen Plasmiden in Zeitfaktoren. Darüber hinaus können virale Transduktion Vektoren für die menschlichen Forscher potentiell schädlich sein. Elektroporation ist eine physikalische methode von Membranpermeabilisierung Induzieren von Zellen, um Hochspannungsimpulse zu unterziehen, so dass Nukleinsäuren in die Zelle transient einzutreten, wo sie auf ihrem Ziel wirken können. Traditionelle Elektroporation Instrumente waren nicht wirksam für die Transfektion von primären Lymphozyten. Allerdings wurde optimierte nächste Generation Elektroporation von Transfizieren T-Zellen mit sehr hohen Effizienz fähig erwiesen, vor allem, wenn das Material zu transfizierenden ist kleine RNA. Der Begriff der nächsten Generation ist lose die beiden neueren Plattformen (zB Neon, Amaxa) von den traditionellen Elektroporation Maschinen zu unterscheiden verwendet. Darüber hinaus ist dieses Verfahren leicht skalierbar für moderates Throughput-Screens mit bis zu etwa 120 kleinem RNAs in einem einzigen Experiment, oft validierten synthetische Reagenzien verwenden. Wichtig ist, dass erfolgreiche Transfektionen nach dem T-Zell-Aktivierung in weniger als 16 Stunden erreicht werden. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass es nicht in stabiler genomischen diedrei führtauf und ist daher vorübergehend. Daher lohnt es sich, den zusätzlichen Aufwand ein stabiles Expressionskonstrukt zu schaffen, die in einen viralen Vektor verpackt werden können und erfolgreich in T-Zellen in den Fällen zum Ausdruck, wo langfristige Expression eines kleinen RNA erforderlich ist.
Wir haben eine neue Generation Transfektion (zB Neon) verwendet , um diverse synthetische einzelsträngige oder doppelsträngige RNA oder LNA – Oligonukleotid für verschiedene Zwecke 11 Werkzeuge zu liefern, 12, 13. Effiziente RNA-Interferenz kann in primären murinen und humanen T-Zellen unter Verwendung von doppelsträngigen kurze interferierende RNA (siRNA) induziert werden. Dieses Protokoll beschreibt optimierte Bedingungen für die Verwendung dieser Technik in der menschlichen Th17-Zellen. Zusätzlich zu siRNAs, im Handel erhältliche synthetische miRNA-Mimetika und Inhibitoren können verwendet werden, miRNA Verstärkung und Verlust der Funktion zu untersuchen. miRNA imitiert sind doppelsträngige RNA-Moleküle sehr ähnlich siRNAs, aber designed mit der Sequenz des reifen endogenen miRNAs. miRNA-Inhibitoren sind, chemisch modifizierten RNA und / oder LNA basierten einzelsträngigen Oligonucleotiden, die zu nativem miRNAs binden und ihre Funktion antagonisieren. Wir haben festgestellt, dass alle diese Tools effektiv in kultivierten primären T-Lymphozyten verwendet werden können, einschließlich, aber nicht für die menschliche Th17 Zellen beschränkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt ein verbessertes Verfahren für die Lieferung von kleinen RNAs in humanen Zellen Th17. Obwohl menschliche Zellen Th17 hier verwendet wurden, diese Methode der Elektroporation mit kleinen RNAs mit anderen primären humanen T-Helfer-Untergruppen, wie zum Beispiel Th1, Th2 und Tregs verwendet werden. Es ist nicht gut für naive CD4 + T – Zellen gearbeitet , so müssen die Zellen vor der Transfektion in Kultur aktiviert werden. Für dieses Protokoll optimierten wir zunächst das in</em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
Materials
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μl Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X | BD biosciences | 555899 | Must make 1X solution with distilled water prior to use |
References
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