JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em> Staphylococcus aureus</em

Published: March 28, 2017
doi:
10.3791/55558
, , ,
1Department of Biology,Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases,Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

Abstract

במאמץ לסכל חיידקים פתוגנים, מארחים קרובים להגביל את הזמינות של חומרים מזינים באתר של זיהום. הגבלה זו יכולה לשנות את שכיחותם של מטבוליטים מפתח אשר גורם רגולטוריים להגיב, התאמת חילוף חומרים תאיים. בשנים האחרונות, מספר החלבונים ו- RNA צמח כמו רגולטורים חשובים של ביטוי גנים ארסיים. לדוגמה, החלבון Cody מגיב רמות של חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP ו נשמרת נרחב חיידקים G + C גראם חיובי נמוך. כרגולטור עולמי Staphylococcus aureus, Cody שולט הביטוי של עשרות ארסיות וגני מטבולית. אנו משערים כי S. aureus משתמשת cody, בין השאר, כדי לשנות מצב מטבולי שלה בניסיון להסתגל לתנאים מגבילים-מזין נתקלו פוטנציאלי בסביבה המארח. כתב יד זה מתאר שיטה לחילוץ וניתוח מטבוליטים מ S. aureus באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מפרט מוניתtrometry, פרוטוקול אשר פותח על מנת לבחון השערה זו. השיטה גם מדגישה מומלצת שיבטיחו הקפדת שחזור, כגון שמירה על מצב יציב ביולוגי אוורור קבוע ללא שימוש בתרבויות chemostat רציפות. ביחס aureus USA200 ס רגיש ל- methicillin לבודד UAMS-1 זן הורי, מוטצית Cody isogenic הציגה עליות משמעותיות חומצות אמינו הנגזרות aspartate (למשל, תראונין ואיזולויסין) וירידות קודמיהם (למשל, אספרטט ו- O -acetylhomoserine ). ממצאים אלה תואמים היטב עם נתוני תעתיק שהושגו עם ניתוח RNA-seq: גנים במסלולים אלה היו למעלה מוסדרים בין 10 ו 800 של פי מוטצית Cody null. צימוד ניתוחים הגלובליים של transcriptome ואת metabolome יכול לחשוף כמה חיידקים לשנות את חילוף החומרים שלהם כאשר הוא מתמודד עם לחץ סביבתי או תזונתי, המספק תובנה פוטנציאל לתוך להתעמלותשינויים iological הקשורים דלדול מזין חוו במהלך זיהום. תגליות אלה עשויות לסלול את הדרך לפיתוח תרופות נוגדת זיהום ואת הרומן.

Introduction

חיידקים פתוגנים חייבים להתמודד עם אתגרים רבים בתוך הסביבה המארחת. בנוסף התקפה ישירה על ידי תאי מערכת חיסון, המארח גם sequesters מזינים חיוניים להישרדות שכפול חיידקים, יצירת חסינויות תזונתיות 1, 2. כדי לשרוד בסביבה העוינת אלה, חיידקים פתוגנים לפרוס גורמים ארסיים. חלק מגורמים אלה מאפשרים החיידק להתחמק התגובה החיסונית; גורמים אחרים כוללים מופרש אנזימי עיכול, כגון hyaluronidase, thermonuclease, וטריפז, אשר עשוי לאפשר לחיידקים לחדש מזינים חסרים על ידי צריכת מרכיבים שמקורם ברקמה 3, 4, 5. ואכן, חיידקים התפתחו מערכות רגולטוריות שקושרים את המצב הפיזיולוגי של התא לייצור של גורמים בחיידק הגורם 6, 7, <s עד class = "Xref"> 8, 9, 10.

גוף גדל והולך של ראיות מצביע Cody כרגולטור קריטי המקשר חילוף חומרים ואת ארסיות. למרות גילו לראשונה subtilis Bacillus בתור מדכא של permease dipeptide (DPP) גן 11, קודי הוא ידוע כיום להיות מיוצר על ידי כמעט כל החיידקים G + C נמוך גראם חיובי 12, 13 ו מסדיר עשרות גנים המעורבים פחמן חנקן המטבוליזם 14, 15, 16, 17, 18, 19. במינים פתוגניים, Cody שולט גם הביטוי של כמה גנים הארסיים החשובים 20, 21,. EF "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 קודי מופעל בתור חלבון קושר DNA על ידי שתי כיתות של הליגנדים: חומצות אמינו מסועפות שרשרת (BCAAs; ואיזולויסין, לאוצין, ו- וואלין [ILV]) ו GTP . כאשר מזין אלה נמצאים בשפע, Cody מדחיק (או במקרים מסוימים, מגרה) תעתיק. כמו חומרים מזינים אלו הופכים מוגבלים, פעילות Cody מצטמצמת בהדרגה, ומביא לתגובת תעתיק מדורגת כי חישוב מחדש של מסלולים מבשרים דרך מסלולי מטבוליים שונים הקשורים למטבוליזם מרכזי 28, 29, 30.
כרומטוגרפיה נוזלית טנדם מצמידים ספקטרומטריית מסה (LC-MS) הינה טכניקה שיכולה לזהות במדויק ולכמת מטבוליטים תאיים-מולקולה קטנה 31. כאשר יחד עם transcניתוח riptome (למשל, RNA-seq), עבודה אנליטית זה יכול לספק תובנות לגבי השינויים הפיסיולוגיים המתרחשים בתגובה לעקה סביבתית או תזונתית. כאן, אנו מציגים שיטה להפקת המטבוליט מתאי סטפילוקוקוס וניתוח שלאחר מכן באמצעות LC-MS. גישה זו נעשה שימוש כדי להדגים את ההשפעות pleiotropic של Cody על הפיזיולוגיה aureus S..

Protocol

1. הכנת תמיסות בופר כן פוספט שנאגר מלוח (PBS; pH 7.4) על ידי דילול פתרון מניות של 10x PBS לריכוז סופי של 1X עם ultrapure (מזוקק ללא יונים) מים. הכן פתרון מרווה ידי שילוב 2 מ"ל של אצטוניטריל, 2 מ"ל של מתנול, 1…

Representative Results

ניתחנו בריכות המטבוליט תאיים ב S. aureus במהלך הצמיחה במבחנה במדיום עשיר, מורכב. כהוכחה עקרוני, השווינו פרופילים המטבוליט בין אוסטאומיאליטיס aureus methicillin-רגישים ס לבודד UAMS-1 (wild-type [WT]) וכן זן isogenic חסר הרגולטור תעתיק העולמי Cody (Δ Cody) <s…

Discussion

כל מטבוליטים המולקולות קטנות מחוברים זו לזו באמצעות מקורותיה המשותפים שלהם מסלולי מטבוליים מרכזיים. במהלך גידול מעריכי, תאי חיידקיים הם על מצב יציב ביולוגי מטבוליות, מתן תמונת מצב של המצב הפיזיולוגי בתנאים ספציפיים. Cody מפקחת הסתפקות מזין ידי היענות ILV ו GTP. כפי ILV ושח?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מסלול NIH כדי פרס העצמאות (להעניק GM 099,893) וקרנות ההפעלה הסגל כדי SRB, כמו גם גרנט פרויקט מחקר (להעניק GM 042,219). הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים לפרשנות, או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X Ambion AM9624 Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Name Company Catalog Number Comments
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

Keywords: Tandem Liquid Chromatography-Mass SpectrometryMetabolite AnalysisStaphylococcus AureusMetabolismPathogenesisNutrient DepletionHost InfectionOptical DensityExtraction BufferQuenching Solution
check_url/fr/55558?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image