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Biochimie

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em>黄色ブドウ球菌</em

Published: March 28, 2017
doi:
10.3791/55558
, , ,
1Department of Biology,Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases,Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。

Abstract

細菌性病原体を阻止するための努力では、ホストは、多くの場合、感染部位での栄養素の利用可能性を制限します。この制限は、細胞の代謝を調節する、調節因子が応答するための鍵代謝物の存在量を変えることができます。近年では、タンパク質やRNAの数は、病原性遺伝子発現の重要な調節因子として浮上しています。例えば、コーディタンパク質は、分枝鎖アミノ酸及びGTPのレベルに応答して、広く、低G + Cグラム陽性細菌で保存されています。 黄色ブドウ球菌のグローバルレギュレーターとして、コーディは、毒性の多数および代謝遺伝子の発現を制御します。私たちは、 黄色ブドウ球菌は、潜在的にホスト環境で遭遇栄養制限条件に適応するための努力でその代謝状態を変更するために、部分的には、コーディを使用すると仮定しました。この原稿は、質量分析と連結した液体クロマトグラフィーを用いて、 黄色ブドウ球菌からの代謝産物を抽出し、分析するための方法を記載していますtrometry、この仮説をテストするために開発されたプロトコル。この方法はまた、このような連続ケモスタット培養を使用することなく、生物学的に定常状態と一定の通気を維持するなど厳しさと再現性を確保するベストプラクティスを、強調しています。 USA200メチシリン感受性黄色ブドウ球菌に対してはUAMS-1親株を分離、同質遺伝子コーディ変異体は、（（ 例えば 、スレオニンおよびイソロイシン）アスパラギン酸に由来するアミノ酸の有意な増加を示し、それらの前駆体の減少、例えば 、アスパラギン酸およびO -acetylhomoserine ）。これらの知見は、RNA配列解析で得られた転写データとよく相関：これらの経路における遺伝子は、 コーディヌル変異体に10〜800倍の間にアップレギュレートしました。トランスクリプトームとメタボロームのグローバルな分析を結合することは、環境または栄養ストレスに直面したとき細菌がPHYのに潜在的な洞察を提供し、彼らの代謝を変化させる方法を明らかにすることができます栄養素の欠乏に関連したiological変化は、感染の間に経験しました。そのような発見は、新規な抗感染薬および治療薬の開発のための道を開くことができます。

Introduction

細菌性病原体は、ホスト環境内の多くの課題に取り組まなければなりません。免疫細胞による直接攻撃に加えて、ホストはまた、栄養免疫1、2を生成し 、細菌の生存および複製に必須の栄養素を隔離します。これらの厳しい環境を生き残るためには、細菌性病原体は、病原性因子を展開します。これらの要因のいくつかは、細菌が免疫応答を回避することができます。他の要因は、組織由来成分3、4、5を消費して不足している栄養素を補充するために、細菌を可能にすることができるようなヒアルロニダーゼ、thermonuclease、およびリパーゼなどの消化酵素を分泌が挙げられます。実際、細菌が毒性、6因子7の産生に対する細胞の生理学的状態を結ぶ調節系を進化させてきました、 <sクラス= "外部参照"> 8、9、10アップ。

証拠の成長体は、代謝および毒性を結ぶ重要な調節因子としてのコーディを指します。第ジペプチドパーミアーゼ（DPP）遺伝子11のリプレッサーとして枯草菌で発見が、コーディは、現在、ほぼ全ての低G + Cグラム陽性細菌12,13によって産生されることが知られており、炭素に関与する遺伝子の多数を調節して窒素代謝14、15、16、17、18、19。病原性の種では、コーディも最も重要な病原性遺伝子の一部20、21の発現を制御し、EF "> 22、23、24、25、26、27コーディは二つの配位子のクラスによってDNA結合タンパク質として活性化される：分岐鎖アミノ酸（BCAA、イソロイシン、ロイシン、およびバリン[ILV]）及びGTP。これらの栄養素が豊富である場合、コーディは抑制する（またはいくつかの場合において、刺激）転写を。これらの栄養素は限らなるように、コーディ活性は徐々に中央代謝に接続された様々な代謝経路を介してその再ルーティング前駆段階的転写応答をもたらす、低減されます28、29、30。
質量分析（LC-MS）に連結されたタンデム液体クロマトグラフィーを正確に小分子の細胞内代謝物31を同定および定量することができる強力な技術です。相互コンダクタンスとペアになったときriptome分析（ 例えば、RNA-配列）、この解析ワークフローは、環境または栄養ストレスに応答して起こる生理的変化への洞察を提供することができます。ここでは、LC-MSを介した黄色ブドウ球菌細胞とその後の分析からの代謝産物の抽出のための方法を提示します。このアプローチは、 黄色ブドウ球菌の生理学上のコーディの多面的な効果を発揮するために使用されています。

Protocol

緩衝溶液の調製超純と1Xの最終濃度になるように10×PBSのストック溶液を希釈することにより（蒸留及び脱イオン）水;リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS）を調製。 アセトニトリルを2mL、メタノール2mL、超純H 2 O 1mLの、及びギ酸の19μL（0.1mMの最終濃度）を組み合わせることにより、クエンチング溶液を調製します。 LC-MSは、超純水にギ酸（0.2％[v / v]の最終濃度）を…

Representative Results

私たちは、豊かな、複雑な培地中でのin vitro成長中の黄色ブドウ球菌における細胞内代謝物プールを分析しました。原理の証明として、我々は比較メチシリン感受性黄色ブドウ球菌骨髄炎の間の代謝産物プロファイルはUAMS-1（野生型[WT]）及びグローバル転写調節コーディ（Δ コーディ ）26を欠く同系株を単離します。プロ?…

Discussion

すべての小分子代謝物は、中央代謝経路におけるそれらの共通の起源を介して相互に接続されています。指数関数的成長の間、細菌細胞は、特定の条件の下での生理的状態のスナップショットを提供し、生物学的および代謝定常状態です。コーディはILV​​とGTPに応答することによって栄養素充足を監視します。 ILVとGTPプール降下として、コーディ活性は、おそらく徐々に栄養枯渇<sup class="…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は独立賞にNIH経路（GM 099893を付与）し、教員のスタートアップ資金SRBに、だけでなく、研究プロジェクト助成（GM 042219を付与）によって部分的に資金を供給されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集および解釈、または出版のために仕事を提出するという決定には役割がありませんでした。

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X Ambion AM9624 Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Name Company Catalog Number Comments
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.
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References

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Tandem Liquid Chromatography-Mass SpectrometryMetabolite AnalysisStaphylococcus AureusMetabolismPathogenesisNutrient DepletionHost InfectionOptical DensityExtraction BufferQuenching Solution

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Citer Cet Article
Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).
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