Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l'analyse des Métabolite Staphylococcus aureus

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour l'extraction des métabolites à partir de Staphylococcus aureus et leur analyse ultérieure par Chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Abstract

Dans un effort pour contrecarrer les bactéries pathogènes, les hôtes limitent souvent la disponibilité des nutriments sur le site de l'infection. Cette limitation peut modifier les abondances des métabolites clés qui répondent facteurs réglementaires, l'ajustement du métabolisme cellulaire. Ces dernières années, un certain nombre de protéines et d'ARN ont émergé comme des régulateurs importants de l'expression des gènes de virulence. Par exemple, la protéine CodY répond à des niveaux d'acides aminés à chaîne ramifiée et GTP et est largement conservée dans bas G + C des bactéries Gram-positives. En tant que régulateur global dans Staphylococcus aureus, CodY contrôle l'expression de douzaines de gènes de virulence et métaboliques. Nous présumons que S. aureus utilise CodY, en partie, de modifier son état métabolique dans un effort d'adaptation aux conditions de limitation de nutriments potentiellement rencontrés dans l'environnement hôte. Ce manuscrit décrit un procédé pour l' extraction et l' analyse des métabolites provenant de S. aureus en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de massespectrométrie, un protocole qui a été développé pour tester cette hypothèse. La méthode met également en évidence les meilleures pratiques qui assureront la rigueur et la reproductibilité, comme le maintien de l'état d'équilibre biologique et l'aération constante sans l'utilisation des cultures de chémostat continue. Par rapport aux USA200 sensibles à la méthicilline de S. aureus souche parentale isoler UAMS-1, le mutant isogénique codY présentait une augmentation significative des acides aminés dérivés de l' aspartate (par exemple, threonine et isoleucine) et des diminutions de leurs précurseurs (par exemple, l' aspartate et O -acetylhomoserine ). Ces résultats sont en bonne corrélation avec les données de transcription obtenus avec l' analyse de l' ARN-seq: gènes dans ces voies ont été régulés à la hausse entre 10 et 800 fois dans le mutant nul codY. Le couplage des analyses globales du transcriptome et métabolome peut révéler comment les bactéries modifient leur métabolisme lorsqu'ils sont confrontés à un stress environnemental ou alimentaire, fournissant un aperçu potentiel dans les Physchangements siologiques associés à l'épuisement des nutriments a connu au cours de l'infection. Ces découvertes peuvent ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux anti-infectieux et thérapeutiques.

Introduction

Les bactéries pathogènes doivent faire face à de nombreux défis dans l'environnement hôte. En plus d'attaque directe par les cellules immunitaires, l'hôte séquestrant également des nutriments essentiels pour la survie et la réplication bactérienne, générant une immunité nutritionnelle ^{1, 2.} Pour survivre à ces environnements hostiles, les bactéries pathogènes déploient des facteurs de virulence. Certains de ces facteurs permettent aux bactéries d'échapper à la réponse immunitaire; D' autres facteurs comprennent sécrétées enzymes digestives, telles que l' hyaluronidase, thermonucléase, et la lipase, ce qui peut permettre aux bactéries de reconstituer les éléments nutritifs manquants en consommant des constituants dérivés de tissus ^{3, 4, 5.} En effet, les bactéries ont développé des systèmes de réglementation qui lient l'état physiologique de la cellule à la production de facteurs de virulence ^{6, 7,} up class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Un nombre croissant de Justificatif CodY comme à régulateur critique reliant le métabolisme et la virulence. Bien que d' abord découvert dans Bacillus subtilis comme un répresseur du gène ^11, Cody est maintenant connu perméase dipeptide (dpp) à produire par la quasi - totalité du faible G + C des bactéries Gram-positives ^{12, 13} et régule des douzaines de gènes impliqués dans le carbone et le métabolisme de l' azote ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} Chez les espèces pathogènes, CodY contrôle également l'expression de certains des plus importants gènes de virulence ^{20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} CodY est activée en tant que protéine de liaison à l' ADN par deux classes de ligands: acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA, isoleucine, leucine et valine [VLI]) et GTP . Lorsque ces nutriments sont abondants, Cody refoule (ou dans certains cas, stimule) la transcription. Comme ces nutriments deviennent limitées, l'activité CodY est progressivement réduite, résultant en une réponse transcriptionnelle à gradient qui réachemine des précurseurs à travers différentes voies métaboliques liés au métabolisme central ^{28, 29, 30.}
Chromatographie liquide en tandem couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est une technique puissante qui peut précisément identifier et quantifier les métabolites intracellulaires de petites molécules ^31. Lorsqu'il est associé à transcanalyse riptome (par exemple, l' ARN-Seq), ce flux de travail d' analyse peut donner un aperçu des changements physiologiques qui se produisent en réponse au stress environnemental ou nutritionnel. Ici, nous présentons une méthode pour l' extraction des métabolites à partir de cellules de Staphylococcus aureus et une analyse ultérieure par LC-MS. Cette approche a été utilisée pour démontrer les effets pléiotropiques de CodY sur la physiologie de S. aureus.

Protocol

1. Préparation de tampon Solutions

1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) par dilution d'une solution mère de 10 x PBS à une concentration finale de 1 x avec ultrapure (distillée et désionisée) de l'eau.
2. Préparer la solution de trempe en combinant 2 ml d'acétonitrile, 2 ml de methanol, 1 ml de H ₂ O ultrapure, et 19 ul (0,1 mM de concentration finale) d'acide formique.
3. Préparez solvant LC-MS A par addition d'acide formique (0,2% [v / v] de concentration finale) de l'eau ultrapure.
4. Préparer solvant LC-MS B par addition d'acide formique (0,2% [v / v] de concentration finale) à de l'acétonitrile.
   NOTE: Toutes les solutions doivent être préparées en utilisant les réactifs la plus haute pureté disponible (généralement qualité de chromatographie liquide à haute performance). Les solutions doivent être préparées avant chaque expérience et stockés sur la glace avant utilisation.

2. Mise en place de l' état d' équilibre de croissance de S. aureus

1. Streak S. aureusouches s d'intérêt pour l' isolement sur gélose de soja tryptique (TSA) à partir d' un stock de glycérol congelé. Incuber à 37 ° C pendant 16-24 h.
2. Ensemencer 4 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) ou un autre milieu approprié dans des tubes d'incubation en verre stériles avec des colonies uniques de chaque souche. Incuber inclinée (~ angle de 70 °) avec la rotation à 60 rotations à 37 ° C par minute (rpm) pendant 16 à 20 h.
   NOTE: cultures pendant la nuit sont sujettes à des gradients d'oxygène lors de l'utilisation des méthodes standard, y compris celles qui sont décrites à l'étape 2.2, qui affectent la physiologie cellulaire. Nous employons donc une stratégie multiple back-dilution pour assurer l'état d'équilibre biologique (voir les étapes 2.4-3.2 ci-dessous).
3. Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique des cultures à l' étape 2.2 à 600 nm (DO _600). Utiliser un milieu stérile comme une référence optique (blanc). Diluer ces cellules à une DO ₆₀₀ de 0,05 dans 50 ml de milieu TSB stérile (pré-chauffée à 37 ° C) dans séparé, 250 ml flacons DeLong.
4. Incubate les cultures à 37 ° C dans un bain-marie avec agitation par secousses à 280 tours par minute.
5. Toutes les 30 minutes, prendre des mesures OD _600; comme les densités optiques augmentent, il peut être nécessaire de diluer les cultures avec du BST afin qu'ils restent dans la plage d'absorbance linéaire du spectrophotomètre.
6. Lorsque les cultures de l' étape 2.5 atteindre une DO ₆₀₀ de ~ 0,8 à 1,0, les sous - culture dans 50 ml de TSB 37 ° C jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,01 à 0,05 et répéter les étapes 2.4 et 2.5.

3. Configuration de prélèvement des échantillons

1. Préparer un lit de glace sèche broyée dans un récipient approprié (par exemple, un plat en verre, seau à glace, ou plus froide).
2. Comme les densités optiques des cultures approchent du point de récolte désiré, ajouter 1 ml d'une solution de trempe dans une boîte de Petri de 35 mm non traitée et pré-refroidir sur de la glace sèche pour ≥5 min.
   REMARQUE: Le « point de récolte désirée » varie en fonction des objectifs expérimentaux. Par exemple, si l'on examine metabolites pendant la croissance aérobie, les indicateurs clés de cet état comprennent l' excrétion d' acétate et re-assimilation de l'acétate au cours de la phase de croissance exponentielle ^{post-32, 33.} En général, ce point doit être à un stade de croissance spécifique (par exemple, phase exponentielle). Les ₆₀₀ valeurs de DO spécifiques associées à ce stade peuvent varier entre les différentes souches bactériennes et milieux de croissance.
3. Placer une fritte de filtre en acier inoxydable (pré-refroidi à -20 ° C) dans un bouchon de caoutchouc et le placer au sommet d'une fiole à vide fixée à un vide interne ou d'une pompe à vide.
4. Appliquer le vide et placer une membrane en ester de cellulose mixte (0,22 um de taille de pores) sur le dessus.
   NOTE: Il est essentiel d'utiliser un filtre avec un diamètre égal à celui de la fritte et au centre correctement ce filtre pour faire en sorte que l'échantillon est tiré à travers le filtre plutôt que sur le bord. Le mouillage de la membrane avec H glacée, stérile ₂ O peut aideravec le positionnement de la membrane.

4. échantillons de récolte

1. A une _DO600 de ~ 0,4-0,5, utilisez une pipette sérologique pour enlever 13 ml de la culture du flacon et d'appliquer l'échantillon au filtre.
2. Après l'ensemble de l'échantillon a été filtré, immédiatement laver le filtre avec ≥5 ml de PBS glacé pour laver les métabolites associés moyennes.
3. Couper le vide et en utilisant une paire de pinces stériles pour retirer le filtre de la fritte. Inverser le filtre (côté de la cellule vers le bas) dans la solution de trempe pré-refroidi.
   NOTE: Il est important d'effectuer les étapes ci - dessus rapidement (c. -à-en quelques secondes) et dès que le liquide a été retiré pour assurer l'extinction rapide des cellules, arrêter l' activité métabolique.
4. Incuber le filtre dans une solution de refroidissement rapide sur la glace sèche pendant ≥20 min.
5. En utilisant des pinces stériles, inverser le filtre (mise à côté de la cellule) dans la boîte de Pétri et en utilisant une micropipette pour rincer les cellules hors de til membrane dans la solution de refroidissement.
6. Remis en suspension les cellules dans une solution de trempe et ensuite transférer la suspension cellulaire à un tube 2 ml résistant aux chocs stérile contenant ~ 100 ul de billes de silice de 0,1 mm. Conservez ce sur la glace sèche ou à -80 ° C.

5. Extraction Métabolite

1. Décongeler les échantillons sur de la glace humide et de perturber les cellules dans un homogénéisateur avec quatre salves de 30 s à 6000 tours par minute, avec deux périodes de refroidissement min sur de la glace sèche entre les cycles.
2. Clarifier les lysats pendant 15 min dans un pré-refroidi, réfrigéré microcentrifugeuse à vitesse maximale ( par exemple, 18.213 xg à ≤4 ° C).
3. Transférer le surnageant dans un microtube propre.
4. En utilisant une micropipette, transférer une petite portion de l'échantillon dans un tube de microcentrifugeuse pour la quantification de la teneur en peptide résiduel à l'étape 6; stocker le reste à -80 ° C.
   REMARQUE: le volume de l'échantillon réservé varie, en fonction du dosage BCA utilisé dans l'étape 6.1. Cel'échantillon doit être stocké sur la glace humide pour une analyse immédiate ou congelée à -80 ° C.

6. Acide bicinchoninique (BCA) Dosage

1. Effectuer un dosage BCA comme recommandé par le fabricant du kit, en utilisant des échantillons provenant de l'étape 5.4 pour déterminer la concentration de peptide résiduel pour chaque échantillon.

7. LC-MS

1. Mélanger 75 ul de S. aureus extrait avec 75 ul de LC-MS solvant B, préparé à l' étape 1.4.
2. Vortex de mélanger et de spin à 13 000 g pendant 5 min.
3. Placer 100 uL de surnageant dans un flacon de Chromatographie en phase liquide (LC) et coiffer. Assurez-vous que l'absence de bulles d'air emprisonnées dans l'échantillon.
4. Charger les flacons LC sur le LC-MS et échantillonneur automatique modifier la liste en cours d'exécution dans le logiciel « Offline Worklist Editor. »
   1. Remplir le champ "Nom de l' échantillon" (par exemple, de type sauvage-1), "Position de l' échantillon" (par exemple, P1-A1), "Méthode" (par exemple, l' acide formique Acid négatif Méthode), et "Fichier de données" (par exemple, de type sauvage-1) colonnes. Cliquez sur le bouton bouton « Enregistrer Worklist ». Ouvrez le logiciel « Poste de travail d'acquisition de données de spectrométrie de masse » et entrée la liste de travail précédemment enregistré. Cliquez sur le bouton « Démarrer Worklist Exécuter » pour démarrer la mesure LC-MS continue.
5. Séparer les échantillons sur une colonne, relier la colonne à un temps de spectromètre de vol (TOF), et coupler le spectromètre TOF avec le système de LC. Utilisez un gradient de phase mobile comme suit: 0-2 min, 85% de solvant B; 3-5 min, 80% de solvant B; 6-7 min, 75% de solvant B; 8-9 min, 70% de solvant B; 10 à 11,1 min, 50% de solvant B; 11,1 à 14 min, 20% de solvant B; et de 14,1 à 24 min, 5% de solvant B; mettre fin à une période de ré-équilibration 10 min à 85% de solvant B et un débit de 0,4 ml min ^-1.
6. En utilisant une pompe isocratique, infuser une solution de masse de référence avec la course pour permettre l'étalonnage de l' axe masse simultanée.
   REMARQUE: Cette étapeest basé sur le manuel standard du spectromètre TOF.
   1. Utiliser le mélange d'acide acétique et D4 hexakis (1H, 1H, 3H-tétrafluoropropoxy) phosphazine que la solution de masse de référence pour effectuer l'étalonnage en temps réel. Utiliser la pompe isocratique avec le débit d'écoulement de 2,5 ml min ^-1 pour la perfusion.

8. Lot Correction des Comtes d'ions

1. Désigner un échantillon pour servir d'échantillon de référence pour la correction de lot (par exemple, de type sauvage, répliquer 1).
2. Calculer la somme des comptages d'ions pour tous les métabolites dans l'échantillon de référence. Répétez ce calcul pour tous les échantillons.
3. Diviser le nombre total d'ions de chaque échantillon par le nombre total d'ions de l'échantillon de référence pour générer un rapport.
4. Diviser le nombre d'ions pour chaque métabolite dans un échantillon par le rapport échantillon / référence pour obtenir un nombre d'ions par lots corrigée pour chaque metabolite.

9. Peptide Normalization

1. réivide les valeurs de comptage d'ions en mode discontinu corrigé pour chaque échantillon obtenu à l'étape 8 par la concentration du peptide déterminé avec le dosage BCA à l'étape 6 pour obtenir une valeur normalisée pour chaque metabolite.
   NOTE: Les chiffres normalisés, d'ions corrigé en discontinu par lots pour chaque métabolite obtenu à l' étape 9.1 peut être comparée directement entre les souches et soumis à une analyse statistique (par exemple, un U de Mann-Whitney -test). En variante, un métabolite connu pour être stable, soit par le traitement ou la génétique peut être utilisé comme un normalisateur pour détecter des changements dus à la décomposition des métabolites. L'inclusion d'une quantité connue de la L-norvaline ou de l' acide gluraric dans le tampon d'extraction peut être utilisée pour corriger la perte au cours du traitement de l' échantillon ^34.

Results

Nous avons analysé les pools de métabolites intracellulaires dans S. aureus pendant la croissance in vitro dans un milieu riche et complexe,. Comme preuve de principe, nous avons des profils de métabolites comparés entre les méthicilline S. aureus sensible à l' ostéomyélite isoler UAMS-1 (type sauvage [WT]) et une souche isogénique manque le régulateur transcriptionnel global CodY (Δ codY) ^26. L'état d' équilibre, l...

Discussion

Tous les métabolites de petites molécules sont reliés entre eux par leurs origines communes dans les voies métaboliques centrales. Au cours de la croissance exponentielle, les cellules bactériennes sont à l'état d'équilibre biologique et métabolique, donnant un aperçu de l'état physiologique dans des conditions spécifiques. CodY surveille la suffisance des éléments nutritifs en répondant à ILV et GTP. Comme ILV et GTP baisse des piscines, l' activité est susceptible CodY réduit progress...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL)	Belco	2510-00250
Gourde de poing, 500 mL	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Porte-filtre/fritte en acier inoxydable	VWR	89428-936
Boîte de Pétri, 35 mm	Corning	430588	Non traité pour culture tissulaire
Membrane mixte d’ester de cellulose, 0,22 &mu ;	Millipore	GSWP02500
Tubes résistants aux chocs, 2 mL	USA Scientific	1420-9600
Billes de silice, 0,1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Homogénéisateur Precellys 24	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Kit de dosage des protéines Micro BCA	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Colonne d’hydrure de diamant de type C Agilent		70000-15P-2
LC-MS à temps de vol (TOF) de masse précise, série 6200	Agilent	G6230B
Quat Pompe, série 1290	Agilent	G4204A  ;
Pompe à poubelle, série 1290	Agilent	G4220A  ;
Entraînement de soupape, série 1290	Agilent	G1107A  ;
Pompe isocratique, série 1290	Agilent	G1310B  ;
TCC, série 1290	Agilent	G1316C  ;
Échantillonneur, série 1290	Agilent	G4226A  ;
Thermostat, série 1290	Agilent	G1330B  ;
chimique
tryptique	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, granulé	Becton Dickinson	214530	Le milieu solide contient 1,5 % [p/v]
gélose Solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4) 10x	Ambion	AM9624	Diluer frais à 1x avec de l’eau ultra-pure
Acétonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Méthanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS ;
toxique Acide formique	Sigma Aldrich	94318	Pour la spectrométrie de masse, 98 %
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Espèce	Souche	Génotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	type sauvage
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	&Delta ; codY ::erm
aLes produits chimiques et matériaux énumérés sont spécifiques à la méthode décrite et n’incluent pas les produits chimiques ou fournitures de laboratoire standard.