Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em> Staphylococcus aureus</em

Summary

Qui si descrive un protocollo per l'estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Abstract

Nel tentativo di contrastare i batteri patogeni, ospita spesso limitano la disponibilità di nutrienti nel sito di infezione. Questa limitazione può alterare le abbondanze dei metaboliti principali alle quali fattori regolatori rispondono, regolando il metabolismo cellulare. Negli ultimi anni, un certo numero di proteine ​​e RNA sono emersi come importanti regolatori dell'espressione genica virulenza. Ad esempio, la proteina CODY risponde a livelli di amminoacidi ramificati e GTP ed è ampiamente conservato in basso G + C batteri Gram-positivi. Come regolatore globale Staphylococcus aureus, Cody controlla l'espressione di decine di virulenza e geni metabolici. Ipotizziamo che S. aureus utilizza Cody, in parte, per alterare il suo stato metabolico nel tentativo di adattarsi alle condizioni di nutrienti limitativo potenzialmente presenti nell'ambiente ospitante. Questo manoscritto descrive un metodo per l'estrazione e l'analisi metaboliti da S. aureus mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massaspettrometria, un protocollo che è stato sviluppato per verificare questa ipotesi. Il metodo evidenzia anche migliori pratiche che garantiranno rigore e riproducibilità, come il mantenimento stato stazionario biologica e costante aerazione senza l'uso di colture chemostato continue. Rispetto alle USA200 meticillina-sensibili S. aureus isolare UAMS-1 ceppo parentale, il isogenico CODY mutante esposto aumenti significativi amminoacidi derivati da aspartato (ad esempio, treonina e isoleucina) e diminuisce nei loro precursori (ad esempio, aspartato e O -acetylhomoserine ). Queste scoperte correlano bene con i dati trascrizionali ottenuti con l'analisi di RNA-seq: geni in questi percorsi sono up-regolata tra 10 e 800 volte nel mutante nullo Cody. Accoppiamento analisi globali del trascrittoma e il metaboloma può rivelare come i batteri alterano il loro metabolismo di fronte a stress ambientale o nutrizionale, permettono di approfondire il potenziale nelle Physmodifiche iological associati a esaurimento degli elementi nutritivi sperimentato durante l'infezione. Queste scoperte possono aprire la strada per lo sviluppo di nuovi agenti anti-infettivi e terapeutica.

Introduction

batteri patogeni devono affrontare molte sfide all'interno dell'ambiente host. Oltre a attacco diretto da parte delle cellule immunitarie, l'host sequestra anche nutrienti essenziali per la sopravvivenza batterica e la replicazione, generando immunità nutrizionale ^{1, 2.} Per sopravvivere a questi ambienti ostili, batteri patogeni distribuire fattori di virulenza. Alcuni di questi fattori permettono ai batteri di eludere la risposta immunitaria; Altri fattori includono secreti enzimi digestivi, come ialuronidasi, termonucleasi, e lipasi, che possono permettere ai batteri di riempire le sostanze nutrienti mancanti consumando costituenti derivate dal tessuto ^{3, 4, 5.} Infatti, i batteri hanno sviluppato sistemi regolatori che legano lo stato fisiologico della cella per la produzione di fattori di virulenza ^{6, 7,} <s up class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Un crescente corpo di evidenze indica Cody come un regolatore fondamentale che collega il metabolismo e virulenza. Sebbene scoperto nel Bacillus subtilis come repressore del gene ¹¹ dipeptide permease (DPP), Cody è ormai noto per essere prodotto da quasi tutti i bassi batteri G + C Gram-positivi ^{12, 13} e regola decine di geni coinvolti in carbonio e azoto metabolismo ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} In specie patogene, Cody controlla anche l'espressione di alcuni tra i più importanti geni di virulenza ^{20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} Cody è attivata come una proteina legante il DNA da due classi di ligandi: amminoacidi ramificati (BCAA, isoleucina, leucina e valina [ILV]) e GTP . Quando questi nutrienti sono abbondanti, Cody reprime (o in alcuni casi, stimola) trascrizione. Poiché questi nutrienti diventano limitato, attività Cody è progressivamente ridotto, con conseguente risposta trascrizionale graduata che ri-rotte precursori attraverso varie vie metaboliche legate al metabolismo centrale ^{28, 29, 30.}
Tandem cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) è una tecnica potente che può identificare accuratamente e quantificare piccole molecole metaboliti intracellulari ^31. Quando è accoppiato con transcAnalisi riptome (ad esempio, RNA-Seq), questo flusso di lavoro di analisi in grado di fornire una conoscenza delle cambiamenti fisiologici che si verificano in risposta a stress ambientale o nutrizionale. Qui, presentiamo un metodo per l'estrazione metabolita da cellule di Staphylococcus aureus e successiva analisi mediante LC-MS. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare gli effetti pleiotropici di Cody su S. aureus fisiologia.

Protocol

1. Preparazione del Buffer Solutions Preparare salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) diluendo una soluzione stock di 10x PBS ad una concentrazione finale di 1x con ultrapura (distillata e deionizzata) acqua. Preparare la soluzione quenching combinando 2 mL di acetonitrile, 2 mL di metanolo, 1 mL di H 2 O ultrapura, e 19 microlitri (0,1 mM di concentrazione finale) di acido formico. Preparare LC-MS solvente A per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale)…

Representative Results

Abbiamo analizzato piscine metaboliti intracellulari di S. aureus durante la crescita in vitro in una ricca, mezzo complesso. Come prova di principio, abbiamo confrontato i profili dei metaboliti tra il sensibile alla meticillina di S. aureus osteomielite isolare UAMS-1 (wild-type [WT]) e un ceppo isogenico manca il regolatore trascrizionale globale Cody (Δ Cody) 26. Stato stazionario, culture esponenziali dei ceppi WT e Co…

Discussion

Tutti i metaboliti piccole molecole sono collegate tra di loro attraverso le loro origini comuni in vie metaboliche centrali. Durante la crescita esponenziale, le cellule batteriche sono a regime biologico e metabolico, fornendo una fotografia dello stato fisiologico in condizioni specifiche. Cody monitora sufficienza nutrienti rispondendo a IBT e GTP. Come ILV e GTP piscine goccia, attività Cody è probabile progressivamente ridotto, regolando l'espressione dei suoi geni bersaglio per adattarsi alla crescente esau…

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.