Valutazione della procedura per eseguire la cystometria sveglia in un modello di mouse
Summary
Questo studio descrive le procedure chirurgiche e le tecniche sperimentali per eseguire la cistometria sveglia in un mouse in movimento. Inoltre, fornisce prove sperimentali per sostenere la sua ottimizzazione e standardizzazione.
Abstract
La revoca della cistometria è stata utilizzata da molto tempo per valutare la funzionalità della vescica in topi liberamente spostati, tuttavia i metodi specifici utilizzati variano tra i laboratori. Lo scopo di questo studio era quello di descrivere la procedura microchirurgica impiegata per l'impianto di un tubo intravesico e la tecnica sperimentale per la registrazione della pressione vescicale urinaria in un topo sveglio, in movimento libero. Inoltre, vengono presentati dati sperimentali per mostrare come la chirurgia, così come il tipo e la dimensione del tubo, influenzano la funzione del tratto urinario inferiore e la sensibilità di registrazione. L'effetto del diametro del tubo sulla registrazione a pressione è stato valutato sia in tubo di polietilene e poliuretano con diversi diametri interni. Successivamente, il tubo più performante di entrambi i materiali è stato impiantato chirurgicamente nella cupola della vescica urinaria dei topi maschi C57BL / 6. La frequenza di micturition di 12 ore, durante la notte, è stata registrata in animali sani e intatti e animali 2, 3, 5 e 7 giorni dopo la chirurgia. Al raccolto, vesciche wSono stati valutati per segni di gonfiore utilizzando osservazione lorda e successivamente sono state trattate per l'analisi patologica. Il più grande grado di gonfiore della vescica è stato osservato nel giorno 2 e 3, che è correlato con i dati comportamentali di annullamento che evidenziano una significativa riduzione della funzionalità della vescica. Al giorno 5, l'istologia della vescica e la frequenza di annullamento erano normalizzati. Sulla base della letteratura e delle prove fornite dai nostri studi, proponiamo le seguenti fasi per la registrazione in vivo della pressione intravesica e del volume annullato in un mouse sveglio: 1) eseguire l'intervento chirurgico utilizzando un microscopio operativo e strumenti microchirurgici, 2) utilizzare polietilene-10 Tubazioni per ridurre al minimo gli artefatti di movimento e 3) eseguire cistometria al giorno 5 postoperatorio, quando si risolve il gonfiore della vescica.
Introduction
La cistometria di riempimento (FC) è un metodo diagnostico che prevede l'inserimento di un catetere nella vescica urinaria per registrare la pressione durante il riempimento lento della vescica. Introdotto per la prima volta nel 1927 come metodo diagnostico clinico per valutare la funzione del tratto urinario inferiore, è rimasto ampiamente utilizzato. 1 Nelle applicazioni di ricerca, FC può essere utilizzato per testare la funzione vescicale nei modelli animali sani e malati e per studiare gli effetti degli agenti farmacologici. I modelli animali roditori sono comunemente usati per indagare la funzione del tratto urinario inferiore. 2 In questo gruppo di mammiferi, FC è stato sviluppato per l'uso in ratti. 3 Qui, la metodologia per implantare un tubo nella vescica urinaria e eseguire FC è stata ben descritta e utilizzata da molti ricercatori con un livello accettabile di riproducibilità. 4 La disponibilità di ceppi di origine transgenica e di colata rendono i topi una specie preziosa per numerose aree di ricerca,Compreso il campo della disfunzione del tratto urinario inferiore. La metodologia utilizzata per eseguire la cistometria del mouse varia notevolmente tra i laboratori, rendendo difficile il confronto dei risultati. 5
Rispetto ai modelli ex vivo , FC conserva l'anatomia del tratto urinario inferiore, consentendo di valutare la funzione coordinata tra la vescica e la sua uscita durante le fasi di stoccaggio e di annullamento del ciclo di micturition. Precedenti ricerche dimostrano che numerosi, comunemente usati anestetici sopprimono la contrazione della micturition. Agenti che conservano la contrazione muscolare liscia della vescica urinaria (uretano, α-cloralosio, ketamina e xilazina), consentendo all'animale di micturate, riducono ancora significativamente la capacità funzionale della vescica e sopprimono la neurotrasmissione. 6 , 7 , 8 , 9 Anche se tecnicamente più impegnativo, FC ha eseguito in awGli animali ambulanti ake conservano l'integrità funzionale del riflesso della micturition.
La funzione del tratto urinario inferiore è influenzata da diversi fattori, tra cui il gonfiore della parete della vescica post-operatoria, lo stress causato dal dolore e dal disagio e dalle influenze ambientali. Utilizzando una tecnica chirurgica che riduce al minimo i danni dei tessuti durante l'impianto di tubi e metodi di registrazione che riducono il movimento del tubo, permettendo allo stesso tempo l'animale ad ambulare liberamente, sono essenziali per ottenere registrazioni accurate e riproducibili.
Se eseguito in modo adeguato, in vivo FC in animali liberamente in movimento può fornire dati che riflettono affidabilmente la funzione fisiologica della vescica. 10 FC in animali liberamente in movimento possono fornire dati sui seguenti parametri; Pressione basale o basale: pressione minima tra due micturition. Pressione intermittente: pressione media tra due micturition. Pressione soglia: pressione intravesica immPrima della micturition. Pressione massima: pressione massima della vescica durante un ciclo di micturition. Attività spontanea (o pressione media oscillatoria intermedia): pressione dell'intermitturazione minus pressione basale. Contrazioni non vuote: aumento della pressione intravesica durante la fase di riempimento, non associata al rilascio di fluido. Compatibilità della vescica: capacità della vescica divisa per pressione di soglia minus pressione basale. Frequenza di micturition: numero di micturitions per unità di tempo. Intervallo di intermittenza: Periodo tra due pressioni di vuoto massime. Capacità della vescica: volume infuso diviso per il numero di micturition. Una descrizione dettagliata di questi parametri e terminologia standardizzata è stata precedentemente pubblicata. 11
FC può essere eseguito usando un metodo di infusione intravesica a ciclo continuo o singolo ciclo. La cistometria continua permette di registrare più cicli di micturition e di scegliere i dati rappresentativi basatiSulla riproducibilità. La sua precisione nella misurazione della capacità della vescica è limitata a causa del volume residuo sconosciuto. Inoltre, è impegnativo raccogliere piccoli volumi vuoti (che a base di ceppo e sesso variano da 30 a 184 μL) nei topi liberamente ambulanti. Utilizzando questo metodo per registrare il volume vuoto è meno accurato rispetto ad una preparazione anestetizzata, ma è superiore in quanto evita gli effetti soppressivi degli anestetici sulla funzione della vescica. La cistometria a ciclo unico deve essere utilizzata per valutare la capacità della vescica. In questo metodo la vescica viene svuotata mediante aspirazione prima dell'infusione e la capacità viene calcolata in funzione della velocità di infusione moltiplicata per il tempo alla massima pressione.
Sebbene sia stata pubblicata la tecnica di esecuzione della cistometria nei piccoli roditori, ha descritto l'intervento eseguito in un topo e ha raccomandato che la cistometria del mouse dovrebbe essere eseguita sotto anestesia uretanica. 10 L'obiettivo di questa comunicazione è tO descrivere sia le tecniche microchirurgiche usate per l'impianto di un tubo intravesico nella cupola della vescica urinaria e la configurazione sperimentale utilizzata per registrare la funzione del tratto urinario inferiore, in vivo , durante il riempimento continuo della vescica e la micturition in un topo sveglio liberamente in movimento. Inoltre, sono stati eseguiti esperimenti per affrontare come la lunghezza del tubo, il diametro e il materiale, nonché la metodologia per eseguire in vivo FC, influenzano la registrazione. Questo protocollo sperimentale riassume le tecniche precedentemente pubblicate e propone una serie di modifiche basate sui risultati sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Materiale ottimale e dimensione del tubo intravesicale
Per determinare il diametro del tubo di effetto sulle registrazioni a pressione, abbiamo provato diversi tubi microfluidici; PE50 (0,58 mm ID), poliuretano PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) e PE10 (0,28 mm ID). Per ogni tubo, la pressione è stata registrata con la pompa di infusione in esecuzione a 1 mL / h, mentre si muove rapidamente il tubo verticalmente da 0 a 30 cm. Gli esperimenti iniziali in vivo hanno tentato di utilizzare tubi …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
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