Evaluatie van de procedure voor het uitvoeren van Awake Cystometry in een muis model
Summary
Deze studie beschrijft de chirurgische procedures en experimentele technieken voor het uitvoeren van wakker cysteometrie in een vrij bewegende muis. Daarnaast biedt het experimentele bewijsmateriaal ter ondersteuning van de optimalisatie en normalisatie.
Abstract
Wakker cystometrie is al lang gebruikt om de blaasfunctie in vrij bewegende muizen te beoordelen, maar de specifieke methoden variëren van laboratoria. Het doel van deze studie was om de microchirurgische procedure te beschrijven die gebruikt werd om een intravesische buis te implantaten en de experimentele techniek voor het opnemen van urineblaasdruk in een wakker, bewegende muis. Daarnaast worden experimentele gegevens voorgesteld om aan te geven hoe de operatie, evenals type en grootte van de buis, invloed hebben op de lagere urinewegfunctie en de opnamegevoeligheid. Het effect van buisdiameter op drukopname werd beoordeeld in zowel polyethyleen als polyurethaanbuis met verschillende inwendige diameters. Vervolgens werd de best presterende buis van beide materialen ingezet in de koepel van de urine blaas van mannelijke C57BL / 6 muizen. Twaalf uur 's nachts mictuurfrequentie werd opgenomen in gezonde, intacte dieren en dieren 2, 3, 5 en 7 dagen na de operatie. Bij oogst, blaas wEre werd beoordeeld op tekenen van zwelling met behulp van grove waarneming en werden vervolgens verwerkt voor pathologische analyse. De grootste mate van blaaszwelling werd waargenomen op dag 2 en 3, die gecorreleerd was met gedragsverwijderingsgegevens die aanzienlijk verminderde blaasfunctie vertoonden. Op dag 5 was de blaar histologie en voiding frequentie genormaliseerd. Op basis van de literatuur en het bewijs dat door onze studies wordt verstrekt, stellen we de volgende stappen in voor in vivo opname van intravesische druk en vochtvolume in een wakker muis: 1) Doe de operatie met behulp van een operationele microscoop en microchirurgische hulpmiddelen. 2) Gebruik polyethyleen-10 Buizen om bewegingsartifacten te minimaliseren, en 3) Cystometrie op postoperatieve dag 5 uitvoeren wanneer blaaszwelling wordt opgelost.
Introduction
Vulcystometrie (FC) is een diagnostische methode waarbij een katheter in de urine blaas wordt geplaatst om druk op te nemen tijdens langzame blaasvulling. Eerst geïntroduceerd in 1927 als een klinische diagnostische methode om de lagere urinewegfunctie te evalueren, is het veel gebruikt. 1 Bij onderzoeksapplicaties kan FC worden gebruikt om blaasfunctie in gezonde en zieke diermodellen te testen en de effecten van farmacologische middelen te onderzoeken. Knaagdierenmodellen worden vaak gebruikt om de lagere urinewegfunctie te onderzoeken. 2 In deze groep zoogdieren werd FC eerst ontwikkeld voor gebruik bij ratten. 3 Hierbij is de methodologie om een buis in de urine blaas te implanteren en FC uit te voeren, goed beschreven en gebruikt door veel onderzoekers met een aanvaardbaar reproduceerbaarheidsniveau. 4 De beschikbaarheid van transgene en knock-out stammen maakt muizen een waardevolle soort voor talrijke onderzoeksgebieden,Inclusief het gebied van dysfunctie van de lagere urinewegen. De methodologie die wordt gebruikt voor het uitvoeren van muiscystometrie varieert aanzienlijk tussen laboratoria, waardoor het moeilijk is om resultaten te vergelijken. 5
In vergelijking met ex vivo modellen behoudt FC de lagere urineweganatomie, waardoor de gecoördineerde functie tussen de blaas en zijn uitlaat tijdens de opslag- en voidingfasen van de mictuurcyclus kan worden beoordeeld. Uit het vorige onderzoek blijkt dat talrijke, meest gebruikte anesthetica onderdrukking van de micturie onderdrukken. Agenten die de samenvatting van de blaasvliesspier (urethaan, a-chloralose, ketamine en xylazine) behouden, laten het dier mictureren, functioneren de functionele blaaskapaciteit aanzienlijk en onderdrukken neurotransmissie. 6 , 7 , 8 , 9 Hoewel technisch meer uitdagend, FC uitgevoerd in awAke ambulerende dieren behoudt de functionele integriteit van het micturiteitsreflex.
De lagere urinewegfunctie wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder postoperatieve blaaswandzwelling, stress door pijn en ongemak, en milieu-invloeden. Met behulp van een chirurgische techniek die weefselbeschadiging minimaliseert tijdens de implantatie van de buis en opnamemethoden die de buisbeweging verminderen, terwijl het dieren ook vrij kunnen worden gelukt, zijn essentieel voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare opnames.
Indien adequaat uitgevoerd, in vivo FC in vrij bewegende dieren kan gegevens verschaffen die de fysiologische blaasfunctie betrouwbaar weerspiegelen. 10 FC in vrij bewegende dieren kan gegevens verstrekken over de volgende parameters; Basale of baseline druk: Minimale druk tussen twee micturities. Intermicturitaire druk: Beteken druk tussen twee micturities. Drempeldruk: Intravesische druk immPrecies voor micturitie. Maximale druk: Maximale blaasdruk tijdens een mictuurcyclus. Spontane activiteit (of gemiddelde intermicturitaire oscillatorische druk): Intermicturiedruk minus basale druk. Non-voiding contracties: Toename in intravesische druk tijdens de vulfase, niet geassocieerd met de afgifte van vloeistof. Blaasovereenkomst: Blaascapaciteit gedeeld door drempeldruk minus basale druk. Micturiteitsfrequentie: Aantal micturities per tijds eenheid. Intermicturiet interval: Periode tussen twee maximale voidingdrukken. Blaascapaciteit: Infused volume gedeeld door het aantal micturities. Een gedetailleerde beschrijving van deze parameters en gestandaardiseerde terminologie is eerder gepubliceerd. 11
FC kan worden uitgevoerd met behulp van een intraveneuze infusiemethode met continue of enkelvoudige cyclus. Doorlopende cystometrie maakt het mogelijk om meerdere mictuurcycli te registreren en representatieve gegevens te selecterenOp reproduceerbaarheid. De nauwkeurigheid van het meten van blaaskapaciteit is beperkt door het onbekende restvolume. Daarnaast is het uitdagend om kleine volgehouden volumes (die gebaseerd zijn op de spanning en het geslacht variëren tussen 30 en 184 μL) in vrije ambulerende muizen te verzamelen. Met behulp van deze methode om volgelopen volume te registreren is minder nauwkeurig in vergelijking met een verdovingspreparaat, maar het is superieur doordat het de onderdrukkende effecten van verdovingsmiddelen op de blaasfunctie vermijdt. Enkelcycluscystometrie moet worden gebruikt om de blaaskapaciteit te beoordelen. Bij deze methode wordt de blaas leeggemaakt door aspiratie voorafgaand aan de infusie en wordt de capaciteit berekend als een functie van de infusiesnelheid vermenigvuldigd met de tijd tot de maximale druk.
Hoewel de techniek van het uitvoeren van cystometrie bij kleine knaagdieren is gepubliceerd, beschreef het de operatie die in een rat werd uitgevoerd en aanbevolen dat de muiscystometrie onder urethaan verdoving moet worden uitgevoerd. 10 Het doel van deze communicatie is tO beschrijf zowel de microchirurgische technieken die gebruikt worden om een intravesische buis in de koepel van de urine blaas te implantaten en de experimentele opstelling die gebruikt wordt om de onderste urinewegfunctie in vivo op te nemen tijdens de continue blaasvulling en micturitie in een wakker, vrij bewegende muis. Daarnaast werden experimenten uitgevoerd om aan te geven hoe slanglengte, diameter en materiaal, evenals de methodologie voor het uitvoeren van in vivo FC, de opname beïnvloeden. Dit experimentele protocol geeft een overzicht van eerder gepubliceerde technieken en stelt een aantal wijzigingen voor die gebaseerd zijn op experimentele resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimale materiaal en grootte van intravesical tubing
Om te bepalen welke effect de diameter van de buis heeft op drukopnamen, hebben we verschillende microfluïdische buizen getest; PE50 (0,58 mm ID), polyurethaan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) en PE10 (0,28 mm ID). Voor elke buis werd druk geregistreerd met de infusiepomp met 1 ml / h, terwijl de buis de verticale beweging van 0 tot 30 cm snel verplaatst. Aanvankelijke in vivo-experimenten probeerden PE50-buizen te gebruiken, maar waren…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury–a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
