Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

Summary

Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.

Abstract

In de studie van volwassen stamcellen en regeneratieve mechanismen, planarian platwormen zijn een nietje in vivo modelsysteem. Dit is grotendeels te danken aan hun overvloedige pluripotente stamcellen bevolking en het vermogen om alle cellen en weefsels types na verwondingen die katastrofisch voor de meeste dieren zou regenereren. Onlangs hebben planarians populairder geworden als een model voor oog regeneratie. Hun vermogen om het gehele oog regenereren (bestaande uit twee weefseltypen: pigmentcellen en fotoreceptoren) maakt de dissectie van de mechanismen reguleren visuele systeem regeneratie. ablatie oog heeft verschillende voordelen boven andere technieken (zoals onthoofding of gaten) voor de behandeling oogspecifieke pathways en mechanismen, de belangrijkste daarvan is dat regeneratie grotendeels beperkt tot alleen oogweefsels. Het doel van deze video artikel is om te demonstreren hoe de planarian optische kop op betrouwbare wijze te verwijderen zonder de hersenen verstoren of de omliggende weefsels.De behandeling van wormen en het onderhoud van een gevestigde kolonie wordt ook beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een 31 G 5/16 inch insuline naald operatief schep de optische kop planarians geïmmobiliseerd op een koude plaat. Deze werkwijze omvat zowel enkele als dubbele oog ablatie, met de ogen regenereren binnen 1-2 weken, waardoor een groot aantal toepassingen. In het bijzonder kan deze ablatietechniek goed te combineren met farmacologische en genetische (RNA interferentie) schermen voor een beter begrip van regeneratieve mechanismen en hun evolutie, oog stamcellen en hun onderhoud en phototaxic gedragsreacties en de neurologische basis.

Introduction

Planarians een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van volwassen stamcellen celgemedieerde regeneratie. Deze niet-parasitaire zoetwater platwormen bezitten het vermogen om alle ontbrekende weefsels, waaronder het centrale zenuwstelsel en de hersenen ¹ regenereren. Bestudeerde al in 1700 ^2, technologische ontwikkelingen op het gebied planarian de afgelopen 10-15 jaar (zoals een gesequenced genoom, in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA interferentie (RNAi) en transcriptomics) hebben deze historische modelorganisme bijgewerkt . In het bijzonder, hebben planarians onlangs steeds populairder geworden als een opkomend model voor oog onderzoek ^3.

Planarians hebben prototypische ogen met twee weefseltypen de fotoreceptor neuronen en pigmentcellen; Dit is de karakterisering van zijn oog stamcellen populatie ingeschakeld en toonden dat veel van de genen die de vertebrate eyekeling zijn geconserveerd in planarians ^{4, 5.} De optische bekers dorsaal gelegen en uit de witte, ongepigmenteerde dendrieten van de fotoreceptor neuronen en halve maanvormige zwarte pigmentcellen en de ogen innerveren de hersenen via een optische opticum. Naast het feit dat een model voor het ophelderen van regeneratieve processen ^6, planarian het oog is geschikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van automomous ^7, gedragsreacties licht (planarians weer negatief phototaxis) ⁸ en de neurologische basis van het gedrag ^9.

Eye regeneratie planarians is grotendeels bestudeerd in twee situaties: in het kader van kopregeneratie onthoofding na ^{4, 10,} en na excisie van alleen de oogweefsels ^{11, 12} </sup>. De meeste planarian studies op het oog van de regeneratie hebben de onthoofding methode, want het is eenvoudig en ongecompliceerd. De meest voorkomende planarian oog excisie methode tot nu toe was verbindingsgat buisje met een fijne glazen capillaire buis ^{13, 14,} hoewel sommige studies hebben ook uitgevoerd amputaties net achter de ogen (gedeeltelijke onthoofding) ^15. Echter, al deze methoden omvatten het verlies van andere dan alleen het oog vele weefsels (zoals de hersenen, darmen, en nephridia), potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Het oog ablatie protocol hier gepresenteerde beperkt excisie aan de oogweefsels (met uitzondering van met hersenen), wat resulteert in gegevens die specifieker zijn voor het oog. Bovendien, in tegenstelling onthoofd wormen die 7-14 dagen om voeding te beginnen, zal Eye weggenomen wormen voeden binnen 24 uur ablatie ^12, waardoor RNAi experimenten (waar RNAi via voedsel wordt geleverd) wordt performed gelijktijdig.

Hoewel oog ablatie is technisch moeilijker om met succes uit te voeren dan onthoofding, hebben de huidige studies met oog uitsnijding niet inbegrepen gedetailleerde instructies over hun procedures. Het doel van deze video artikel is onderzoekers in staat te stellen de planarian optische kop consequent te verwijderen zonder de onderliggende hersenweefsel en het verwijderen van zo weinig andere weefsels mogelijk te maken. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor zowel enkele als dubbele oog ablatie en is toepasbaar op een groot aantal onderzoeken. Zoals de meeste regeneratie testen oog wordt ablatie goed geschikt voor combinatie met zowel farmacologische en genetische (RNAi) schermen en gedragsonderzoek. Hier beschrijven we methoden voor de behandeling van wormen, het handhaven van een planarian kolonie, en het oog ablatie techniek zelf.

Protocol

1. Dierlijke Cultuur en Handling Opmerking: In dit protocol wordt Schmidtea mediterranea, een diploïde planarian soort met een genoom gesequenced 16, 17 die gewoonlijk wordt gebruikt voor regeneratie onderzoek. De test is even succesvol bij andere soorten, zoals tijgerplatworm en girardia dorotocephala (die commercieel verkrijgbaar zijn). Handhaven wormen "worm water" van de 0,…

Representative Results

Voor de eerste 1-2 uur na de operatie, kunnen dieren vertonen verminderde beweging ten opzichte van intacte wormen (maar ze zullen nog bewegen). Indien gewenst, wormen eet binnen 24 uur van chirurgie (bijvoorbeeld voor RNAi voeding). Bij het volgen van eye regeneratie in dezelfde individuen over de tijd, zorg ervoor dat je een foto van elke worm te nemen, zowel voorafgaand aan de operatie (intact) en op 1 uur na ablatie (HPA). Per 4 dagen na ablatie (dpa) regenereren van pigmentcellen zi…

Discussion

Dit oog ablatietechniek verbetert de huidige methoden (bijvoorbeeld gaten) door het uitsluiten hersenweefsels en beperken excisie voornamelijk aan de oogweefsels. Met de praktijk, kan deze techniek worden uitgevoerd door de meeste mensen, van technici met ervaring in microsurgeries te onervaren maar gewetensvolle undergraduate studenten. Aanbevolen wordt deze techniek vele malen worden uitgevoerd voor het gebruik in ablaties experimenten, waaronder (indien mogelijk) is bevestigd door volledige verwijdering van alle oogw…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional