Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

Summary

Este protocolo mostra como para excisar consistentemente olhos planarian (copos óptica), sem perturbar os tecidos circundantes. Utilizando uma agulha de seringa de insulina e, de um ou ambos os olhos pode ser cauterizado para facilitar investigações sobre os mecanismos que regulam a regeneração do olho, a evolução de regeneração visual, e a base neural de comportamento induzida pela luz.

Abstract

No estudo de células estaminais adultas e os mecanismos regenerativos, vermes planarian são um grampo no sistema modelo in vivo. Isto é devido em grande parte à sua população de células-tronco pluripotentes abundante e capacidade de regenerar todos os tipos de células e tecidos após lesões que seria catastrófico para a maioria dos animais. Recentemente, planárias ganharam popularidade como um modelo para a regeneração olho. A sua capacidade de regenerar todo o olho (composto de dois tipos de tecidos: células pigmentares e fotorreceptores) permite a dissecção dos mecanismos que regulam a regeneração sistema visual. ablação do olho tem diversas vantagens sobre outras técnicas (tais como a decapitação ou furador) para examinar as vias e os mecanismos específicos do olho, o mais importante dos quais é que a regeneração é largamente restringida a tecidos oculares sozinho. A finalidade deste artigo vídeo é para demonstrar como para remover de forma fiável a taça óptica planarian sem perturbar o cérebro ou tecidos circundantes.O tratamento de vermes e manutenção de uma colónia criada também é descrito. Esta técnica utiliza uma 31 L, agulha de insulina 16/05 polegadas para colher cirurgicamente para fora a cúpula óptica de planarians imobilizados numa placa fria. Este método engloba tanto simples e dupla ablação olho, com olhos de regeneração no prazo de 1-2 semanas, para permitir que uma ampla gama de aplicações. Em particular, esta técnica de ablação pode ser facilmente combinado com (interferência de ARN) telas farmacológicas e genéticas para uma melhor compreensão dos mecanismos de regeneração e da sua evolução, células estaminais do olho e a sua manutenção, e respostas comportamentais phototaxic e sua base neurológica.

Introduction

Planárias são um poderoso organismo modelo para o estudo da regeneração mediada por células-tronco adultas. Estes vermes de água doce não-parasitárias possuem a capacidade de regenerar a quaisquer e todos os tecidos em falta, incluindo o sistema nervoso central e do cérebro ^1. Estudado, tanto para trás como os 1700s ^2, avanços tecnológicos no domínio planarian durante os últimos 10-15 anos (tais como um genoma sequenciado, hibridao in situ, imuno-histoquímica, de ARN de interferência (ARNi), e transcriptómica) ter actualizado este organismo modelo histórico . Especificamente, planárias recentemente ganhou popularidade como um modelo emergente de pesquisa olho ^3.

Planárias têm olhos prototípicas com apenas dois tipos de tecido, os neurónios fotorreceptores e células de pigmento; esta permitiu a caracterização da sua população de células-tronco olho e demonstrado que muitos dos mesmos genes regulando vertebrado de olhosenvolvimento são conservados em planarians ^{4, 5.} Os copos óptica estão localizados dorsalmente e composta dos dendritos branco, não pigmentadas dos neurónios fotorreceptores e as células de pigmento preto semi-lunar, e os olhos inervam o cérebro através de um quiasma. Além de ser um modelo para elucidar os processos regenerativos ^6, o olho planarian é bem adequado para o estudo da evolução de mecanismos visuais ^7, as respostas comportamentais a luz (planarians exibir fototaxia negativo) ^8, e a base neurológica de comportamento ^9.

Regeneração olho em planarians tem sido largamente estudada em dois contextos principais: como parte de regeneração da cabeça seguinte decapitação ^{4, 10,} e após a excisão de apenas os tecidos do olho ^{11, 12} </sup>. A maioria dos estudos sobre a regeneração planarian olho têm usado o método de decapitação, como é simples e direta. O método de excisão olho planarian mais comum até à data tem sido através de perfuração com um tubo capilar de vidro fino ^{13, 14,} embora alguns estudos também realizada amputações apenas por trás dos olhos (decapitação parcial) ^15. No entanto, todos estes métodos envolvem a perda de muitas outras do que apenas o olho tecidos (tais como tumores do cérebro, intestinos, e nefrídios), potencialmente complicar a interpretação dos resultados. O protocolo de ablação olho aqui apresentada restringe a excisão para os tecidos do olho (excluindo especificamente cerebral), resultando em dados que são mais específicos para o olho. Além disso, ao contrário de vermes decapitados que levam 7-14 dias para iniciar a alimentação, olho ablated vermes irá alimentar dentro de 24 h de ablação ^12, permitindo que as experiências de ARNi (onde ARNi é entregue através dos alimentos) para ser performed concorrentemente.

Embora a ablação do olho é tecnicamente mais difícil de executar com êxito do que a decapitação, estudos atuais que envolvem a excisão olho não incluíram instruções detalhadas sobre os seus procedimentos. O objetivo deste artigo vídeo é para permitir aos investigadores para remover consistentemente o copo óptica planarian sem perturbar os tecidos cerebrais subjacentes e removendo como alguns outros tecidos quanto possível. Este método pode ser utilizado para ambos simples e dupla ablação olho e é aplicável a uma vasta gama de investigações. Como a maioria dos ensaios de regeneração, ablação olho é bem adequado para combinação com ambas as telas farmacológicas e genéticas (ARNi), bem como estudos comportamentais. Aqui nós descrevemos métodos para o tratamento de vermes, mantendo uma colônia planarian, ea técnica de ablação de olho em si.

Protocol

1. Cultura Animal e Manuseamento NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, uma espécie planarian diplóides com um genoma seqüenciado 16, 17 que é comumente usado para a pesquisa de regeneração. No entanto, o ensaio é igualmente bem sucedido com outras espécies, tais como Girardia Tigrina e Girardia dorotocephala (que se encontram comercialmente disponível). Manter verm…

Representative Results

Para o primeiro 1-2 h após a cirurgia, os animais podem apresentar movimento diminuiu em comparação com vermes intactos (no entanto, eles ainda se move). Se desejado, vermes vai comer dentro de 24 horas após a cirurgia (por exemplo, para a alimentação de RNAi). Ao seguir a regeneração olho nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, certifique-se para tirar uma fotografia de cada verme tanto antes da cirurgia (intacto) e em 1 h após ablação (HPA). Ao fim de 4 dias após a ablaç…

Discussion

Esta técnica de ablação olho melhora sobre os métodos correntes (tais como furador) por excluindo os tecidos cerebrais e restringindo excisão principalmente para os tecidos do olho. Com a prática, esta técnica pode ser realizada pela maioria dos indivíduos, de técnicos experientes em microcirurgias para estudantes de graduação inexperientes, mas de consciência. Recomenda-se que esta técnica ser praticadas muitas vezes antes de usar ablações em experimentos, incluindo (quando possível) confirmação de re…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional