Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 – 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 – 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.
Drosophila melanogaster 광 수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록은 단일 분자 수준에서 이노시톨 – 지질 신호 및 과도 수용 수용체 (Transient Receptor Potential, TRP) 채널을 연구하기 위해 D. melanogaster 분자 유전학의 사용을 가능하게하는 무척추 동물 영상 전달 분야를 혁신했습니다. 소수의 연구실에서는이 강력한 기법을 익혔으며 고도로 제어 된 조건에서 빛에 대한 생리적 반응을 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 및 세포 외 매체를 제어 할 수 있습니다. 막 전압; 및 다양한 이온 성 또는 pH 지시약과 같은 약리학 적 화합물의 세포 내 및 세포 외 매체로의 신속한 적용을 포함한다. 예외적으로 높은 신호 대 잡음비로,이 방법은 어두운 자발적 및 광 유도 단일 전류 (자발적 및 양자 범프)와 거시적 인 빛 유도 전류 (LIC)를 죄로부터 측정 할 수 있습니다gle D. melanogaster 광 수용체. 이 프로토콜은 전기 생리 학적 및 광학적 기록을 모두 포함하는이 기술을 수행하는 데 필요한 모든 주요 단계를 아주 자세하게 설명합니다. 목욕실에서 손상되지 않고 생존 가능한 생체 외 고립성 구강 내막염 제거를위한 파리 망막 해부 절제술이 기술되었다. 전체 셀 및 형광 이미징 측정을 수행하는 데 필요한 장비도 자세히 설명합니다. 마지막으로, 확장 된 실험 동안이 섬세한 준비를 사용함에있어서 함정이 설명됩니다.
약 100 년 전에 시작된 초파리 Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) 에 대한 광범위한 유전 연구는 D. melanogaster fly를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 실험 모델로 확립했다. 아래에서 설명하는 방법은 D. melanogaster 분자 유전학의 누적 된 출력과 전체 셀 패치 클램프 녹음의 높은 신호 대 잡음 비율을 결합합니다. 이 조합은 네이티브 환경과 단일 분자의 최고 해상도 모두에서 이노시톨 – 지질 시그널링 및 TRP 채널 조절 및 활성화의 모델로서 D. melanogaster 광 변환의 연구를 허용한다.
D. melanogaster photoreceptors에 대한 전체 세포 기록 방법의 적용은 무척추 동물의 phototransduction에 대한 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이 방법은 Hardie 1 과 indep가 개발했습니다.Ranganathan과 동료들에 의해 2 ~ 26 년 전에 끝내었고 , D. melanogaster 의 광범위한 유전자 조작 도구를 이용하고 phototransduction과 inositol-lipid signaling의 메커니즘을 밝히기 위해 사용되었다. 처음에는이 기술은 해부학 과정에서 빛 민감도가 급격히 감소하고 개복 수확량이 낮아 세부적인 정량 연구가 어려웠습니다. 나중에 패치 피펫에 ATP와 NAD를 첨가하면 장기간의 정량적 레코딩을위한 준비의 적합성이 크게 증가했습니다. 그 후, 분자 수준에서 신호 전달 메커니즘의 광범위한 특성이 실현되었다.
현재, D. melanogaster 광전 변환은 phosphoinositide 신호 및 TRP 채널이 단일 분자 분해능으로 생체 외에서 연구 될 수있는 몇 안되는 시스템 중 하나입니다. D. melanogaster 광전 변환과 저를 만듭니다 .thodology는이 메커니즘을 매우 민감한 모델 시스템으로 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 망막을 해부하고 주위 안료 (glia) 세포에서 분리 된 ommatidia를 기계적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 이것은 photoreceptor 세포 몸에 기가 씰과 전체 세포 패치 클램프의 형성을 가능하게합니다. 다행히 대부분의 신호 전달 단백질은 횡문근 막에만 국한되며 확산되지 않습니다. 또한 신호 구획과 세포 사이에는 칼포틴 (calciumphotin)이라고 불리는 움직일 수없는 칼슘 2+ 완충액이 있으며, 미포 질에서 Na + / Ca 2+ 교환기 (CalX)의 발현 수준이 높습니다. 함께 rhabdomere, calphotin 완충액 및 CalX의 높은 발현에 단백질 감금은 필수 구성 요소의 손실없이 상대적으로 연장 된 ( 즉 ~ 20 분까지) 전체 세포 녹음을 허용합니다빛에 대한 높은 감도를 유지하면서 광전도 공정의 다음 프로토콜은 고립 된 눈꺼풀 아래를 얻는 방법과 광 변환 캐스케이드의 고유 특성을 보존하는 것처럼 보이는 전체 세포 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 된 바퀴벌레 ( Periplaneta americana ) 6 및 크리켓 ( Gryllus bimaculatus ) 7 외피에 대한 전체 세포 패치 클램프 실험은 D. melanogaster 에 대해 기술 된 것과 유사하게 수행 되었다. 또한 파일 클램프 ( 리마 scabra )와 가리비 ( Pecten의 irradians )의 dissociated photoreceptors에 대한 패치 클램프 실험은 전체 셀 8 및 단일 채널 측정을 허용 디 melanogaster 에 실시와 약간 다른 방식으로 수행되었다 9 . 여기,이 기술을 사용하여 디 melanogaster 에서 얻은 주요 업적이 설명되어 있습니다. 토론 나는이 기법의 몇 가지 함정과 한계에 대한 설명은 없습니다.
D. melanogaster 광 수용체에 대한 전체 세포 기록의 응용은 TRP 채널 27 , 28 , 29 및 INAD 30 , 31 , 32 스캐 폴드 단백질과 같은 새로운 신호 전달 단백질의 발견 및 기능적 해명을 가능하게했다. 이 기법을 처음 도입 한 이래로 이온 반응 메커니즘에 대한 장기적인 기본 문제를 해결할 수있었습니다. 이것은 멤브레인 전압과 세포 및 세포 내 이온 조성물 19 , 28 을 정확하게 제어 할 수있는 능력이 부여 되었기 때문에 발생했습니다.
D. melanogaster 에서의 패치 클램핑 기술의 주요 장애는 격리 된 개 구균 제거제의 취약성이다정액. 상세한 연구에 따르면 광전도 기계 장치의 무결성은 ATP의 지속적인 공급, 특히 빛에 노출되는 동안 ATP의 대량 소모로 이어지는 것이 중요합니다. 불행히도 패치 피펫으로 광 수용체 막에 도달하는 데 필요한 안료 ( 즉, glia) 세포의 기계적 스트라이핑은 ATP 생산에 필요한 주요 대사 물질을 제거합니다 33 . 기록 피펫으로의 외인성 ATP의 적용은 다량의 ATP에 대한 요건을 부분적으로 충족시킨다. ATP의 공급 부족은 TRP 채널의 자발적인 활성화와 빛 활성화 된 채널에서 광 전달 메커니즘의 해리로 연결되어 세포질 Ca 2+의 증가와 빛에 대한 정상적인 반응의 폐지를 초래한다. 이러한 일련의 사건은해부 절차에 의해 광 수용체가 아니라 오히려 ATP의 세포 고갈. 이러한 일련의 사건이 발생하지 않도록하고 정상적인 빛 반응을 유지하려면 광 수용체를 강렬한 빛에 노출 시켜서는 안되며 많은 양의 ATP를 섭취해야합니다. 또한, NAD는 기록 피펫에 포함되어야하며 아마도 미토콘드리아에서 ATP 생산을 촉진해야한다. 자발적 및 양자 범프의 측정을 위해서는 희미한 조명 만 사용되기 때문에 위의 어려움은 최소화됩니다. 실제적으로 안정된 전체 세포 기록은 ~ 20 ~ 25 분 동안 유지 될 수 있지만, 반응 속도론이이 기간 동안 느려지는 경향이있다. 해리 된 각화 증의 단일 제제는 최대 2 시간 동안 생존 할 수있다.
고립 된 개조 제제의 또 다른 단점은 TRP의 접근 불가능 성으로 해석되는 미생물의 접근 불가능 성이며,TRPL 채널을 녹음 피펫에 연결하여 단일 채널 녹음을 방지합니다. 그들이 개발 한 방법을 사용하여, Bacigalupo와 동료들은 횡문 면도 37 에서 단일 채널 활동을 직접 기록하는 데 성공했다. 그러나,이 채널 활성은 조직 배양 세포에서 이종적으로 발현 된 TRPL 채널의 것과는 다르며, 고립 된 개 구균 34 에서 얻은 샷 잡음 분석에서 파생 된 TRP 채널 활성과는 다릅니다. 아마도,이 방법을 사용할 때 해부 절차는 광 수용체 세포를 크게 손상 시켰습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구의 실험적 부분은 미국 이스라엘 바이 사이언스 재단 (BM 및 IL), 이스라엘 과학 재단 (ISF), 독일 – 이스라엘 프로젝트 개발 (DIP) (BM으로), 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC 교부금 번호 : BB / M007006 / 1 및 BB / D007585 / 1)에서 RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |