Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien
Summary
Les granules de stress (SG) sont des structures cytoplasmiques non moulues qui se forment dans des cellules exposées à une variété de contraintes. Les SG contiennent des ARNm, des protéines de liaison à l'ARN, des petites sous-unités ribosomales, des facteurs liés à la traduction et diverses protéines de signalisation cellulaire. Ce protocole décrit un flux de travail qui utilise plusieurs approches expérimentales pour détecter, caractériser et quantifier les SG de bonne foi .
Abstract
Les cellules sont souvent confrontées à des changements environnementaux soudains. Les granulés de stress (SG), les complexes de ribonucléoprotéines cytoplasmiques qui se forment dans des cellules exposées aux conditions de stress sont impliqués dans divers aspects du métabolisme et de la survie cellulaire. Les SGs modulent les voies de signalisation cellulaire, l'expression génique post-transcriptionnelle et les programmes de réponse au stress. La formation de ces granules contenant des ARNm est directement liée à la traduction cellulaire. L'assemblage SG est déclenché par l'initiation de la traduction inhibée, et le démontage SG est favorisé par l'activation de la traduction ou par un allongement de la traduction inhibé. Cette relation est encore soulignée par la composition SG. Les composants SG de base sont des complexes de pré-initiation de traduction bloqués, des ARNm et des protéines de liaison à l'ARN sélectionnées (RBP). Le but de l'assemblage de SG est de conserver l'énergie cellulaire en séquestrant des ARNm de ménage de maintien de la traduction, ce qui permet une traduction améliorée des protéines sensibles au stress. En complémentSur les constituants de base, tels que les complexes de préinitiation de traduction bloqués, les SG contiennent une pléthore d'autres protéines et des molécules de signalisation. Les défauts dans la formation de SG peuvent nuire à l'adaptation cellulaire au stress et peuvent donc favoriser la mort cellulaire. Les SG et les granulés contenant de l'ARN similaires ont été liés à un certain nombre de maladies humaines, y compris les troubles neurodégénératifs et le cancer, conduisant à l'intérêt récent à classer et à définir les sous-types de granules d'ARN. Ce protocole décrit des analyses pour caractériser et quantifier les SG de mammifères.
Introduction
Les cellules utilisent de nombreux mécanismes pour répondre au stress. Certaines réponses se produisent au niveau post-transcriptionnel et impliquent la régulation de la traduction et / ou de la stabilité de l'ARNm 1 , 2 . L'arrestation et la dégradation translationnelle de l'ARNm modulée par le stress sont associées à la formation de foyers cellulaires non mémarchiques spécifiques, les plus classés étant les Granules de Stress (SG) 3 . Les SG sont des foyers cytoplasmiques qui concentrent les mRNP non traduits dans des cellules qui ont réussi à réagir au stress ( p. Ex., Oxydation, choc thermique, altération des nutriments et infection virale) 4 . En plus des mRNAs non traduits, les SG contiennent des facteurs d'initiation de la traduction, des protéines de liaison à l'ARN et diverses protéines de signalisation 5 . Les SG sont des biomarqueurs de la traduction inhibitrice des protéines et de l'altération du métabolisme de l'ARN et ont été liés à la survie cellulaire et à l'apoptose, la voie de signalisationS, et les processus nucléaires 5 .
Les SG sont des entités dynamiques, et leur formation est étroitement liée à l'état de la traduction cellulaire 6 . En dépit de leur aspect apparemment solide, la plupart des composants de la protéine SG passent rapidement et à l'extérieur, avec un temps de séjour de secondes. Alors que les SG persistent pendant des minutes, la plupart de leurs composants sont en flux rapide. L'inhibition de l'initiation de la traduction et le désassemblage conséquent des polysomes de traduction favorisent la formation de SG; Ainsi, les SG sont en équilibre avec la traduction des polysomes. Cet équilibre de polysome / SG est la clé pour distinguer les SG de bonne foi des autres foyers induits par le stress 6 , 7 .
L'initiation à la traduction d'arrestation implique la conversion de complexes de pré-initiation compétents en traduction qui contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction (EIF) et des sous-unités ribosomales 40S (s) O-called complexes 48S) dans des complexes qui sont paralysés en translation (complexes appelés 48S *) qui peuvent s'unir aux SG 4 , 6 . Les SG sont favorisés par l'arrestation translationnelle à deux étapes différentes en amont de la formation complexe 48S: interférence avec les fonctions du complexe eIF4F de liaison de cap ( par exemple, ciblant sa sous-unité eIF4A) ou la phosphorylation de la sous-unité α du facteur d'initiation de la traduction eIF2, médiée par une Ou plus des quatre kinases eIF2. La présence de complexes 48S bloqués ( c.-à-d. Sous-unités ribosomales 40S et facteurs d'initiation de traduction sélectionnés) est une caractéristique des SG 8 , 9 .
Les SG ont été liés à divers états pathologiques, tels que les infections virales, la neurodégénérescence, l'auto-immunité et le cancer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Les formes mutées de plusieurs composants SG sont associées à des maladies neurodégénératives ( par exemple, une sclérose latérale amyotrophique) dans laquelle les neurones présentent des inclusions pathologiques intracellulaires pouvant jouer un rôle actif dans la mort neuronale 13 . Certains virus détournent les composants SG pour inhiber la formation du SG et pour améliorer la replication virale 14 . Des études récentes associent également les SG au cancer 15 et à la survie des cellules cancéreuses dans les traitements de chimiothérapie et de radiothérapie 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Bien que de tels résultats aient suscité un grand intérêt pour la biologie SG, bon nombre des rapports publiés manquent de contrôles importants pour distinguer la formation de SG d' une bonne foi d'autres foyers induits par le stress.
Les SG ont d'abord été décrits comme des foyers cytoplasmiques non mécontentés composés de protéines de liaison à l'ARNm sélectionnées (RBP), y compris l'antigène ntracellulaire à cellules T 1 (TIA-1) et la protéine à liaison poly-A (PABP); Facteurs d'initiation de la traduction; ARNm polyadénylé; Et petites sous-unités ribosomales 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionnellement, leur composition a été déterminée par des techniques telles que l'immunocoloration et l'expression ectopique de protéines marquées par fluorescence 23 , 24 . En raison de leur nature très dynamique, l'immunocolorisation des protéines SG et / ou des ARNm reste la méthodologie déterminante pour la détection des SG 23 , 24 . À ce jour, de nombreux RBP et autres protéines (plus de 120 protéines distinctes) sont décrits comme composants SG 11 . Autant de SLes protéines localisées G changent leur localisation à la fois de manière indépendante du stress et indépendantes et peuvent s'accumuler à d'autres compartiments et foyers intracellulaires, il est important de choisir des marqueurs SG corrects et d'utiliser des critères fonctionnels pour distinguer les SG d'autres types de stress induit Les foyers. Les SG de bonne qualité contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction et de petites sous-unités ribosomales et sont en équilibre dynamique avec la traduction.
Ce flux de travail simple est conçu pour déterminer si les foyers induits par le stress sont des SG de bonne foi . Ce flux de travail comprend plusieurs approches expérimentales utilisant des cellules U2OS, des cellules couramment utilisées pour étudier les SG. Ces cellules sont idéales, car elles ont un grand cytoplasme, sont relativement plates et s'attachent fortement aux lamelles de verre. D'autres types de cellules peuvent être utilisés pour étudier les SG, mais il est important de savoir que les différences de temps, de concentration de médicament et d'abondance de protéines de nucléation SG peuvent modifier la cinétique et la compositionSition. En outre, certaines cellules répondent à la fixation du paraformaldehyde en formant des bulles de surface cellulaire, ce qui donne alors une apparence ruffée qui provoque la localisation ponctuelle de certains marqueurs SG; Sans analyse minutieuse, ceux-ci peuvent être mal classés en SG. Cela met en évidence la nécessité d'évaluer tous les critères requis pour identifier les foyers induits par le stress en tant que SG de bonne foi . La vinorelbine (VRB), une thérapeutique contre le cancer qui favorise les SG 20 , ainsi que l'arsénite de sodium (SA), un inducteur SG robuste et bien caractérisé, sont utilisés comme contraintes pour les expériences de ce protocole.
Les SG canoniques contiennent de multiples marqueurs SG (à la fois des protéines et des ARNm) qui se placalisent dans les foyers cytoplasmiques. Ce protocole utilise à la fois l'immunofluorescence et l'hybridation in situ fluorescente (FISH) pour détecter la localisation des marqueurs de protéines et de l'ARNm polyadénylé 22 , respectivement. En bref, l'immunofluorescence indirecte utilise des anticorps ( i.E. Anticorps primaires) spécifiques d'une protéine donnée pour la détecter dans la cellule. Ensuite, les anticorps secondaires (habituellement spécifiques à l'espèce) attachés aux fluorochromes reconnaissent l'anticorps primaire et révèlent la localisation des protéines cibles. La microscopie fluorescente est utilisée pour détecter le signal localisé dans la cellule. L'utilisation d'anticorps produits dans différentes espèces et leur détection avec des anticorps secondaires de couleur différente permet de détecter la localisation de multiples anticorps, ce qui indique que leurs cibles protéiques se trouvent au même endroit 23 . Il est important de sélectionner des marqueurs qui ont été vérifiés pour la colocalisation dans les SG de bonne foi .
FISH utilise une sonde marquée qui se base sur une séquence d'ARN ou d'ADN spécifique 25 . Pour détecter l'ARNm, ce protocole utilise une sonde oligo (dT) 40 biotinylée qui s'hybride (ou paires de bases) à la queue polyA de l'ARNm ( c'est-à-dire polyA FISH). La sonde biotinylée est alors détectée en utilisant une streptavidine à conjugaison fluorescente, car la streptavidine a une forte affinité pour la biotine. Lors de l'évaluation des SG, il est important de coupler PolyA FISH avec immunofluorescence détectant un marqueur SG, comme dans les SG SG de bonne foi , les deux signaux devraient être localisés.
En utilisant ce protocole, la colocalisation est évaluée de multiples façons. Dans une image multi-canal ( c'est-à-dire RVB: rouge, vert et bleu), la colocalisation modifie la couleur du signal superposé ( p. Ex ., Le rouge colocalisé et le vert apparaissent en jaune) 23 . En outre, la colocalisation est quantifiée graphiquement en utilisant l'analyse de balayage de ligne, où l'intensité de chacune des couleurs est mesurée sur une ligne donnée 8 , 20 . Ce protocole décrit deux procédures d'analyse de balayage en ligne utilisant ImageJ 26 . Une procédure est manuelle et passe à travers le processus entier,L'autre utilise une macro, ou un programme simple qui automatise les étapes manuelles. Il est important de passer par le programme manuel pour comprendre la procédure macro.
Les SG se forment dans les cellules où la traduction est réprimée; Par conséquent, les cellules avec SG devraient afficher des niveaux réduits de traduction globale par rapport aux cellules non traitées. Expérimentalement, la ribopuromycylation est utilisée. La puromycine et l'emétine sont ajoutées aux cellules pendant une courte durée avant la fixation, ce qui permet à la puromycine d'incorporer dans la formation active de polypeptides, provoquant la terminaison 27 , 28 . Le traitement par emetine est nécessaire pour empêcher le redémarrage 29 . La puromycine peut ensuite être détectée en utilisant un anticorps anti-puromycine, en donnant un instantané de la traduction active. Cette méthode est utilisée car elle est rapide, ne requiert pas de pré-affamer avec un milieu dépourvu d'un acide aminé particulier (et potentiellement précontrainte des cellules) et révèle leLocalisation subcellulaire de la traduction des protéines. D'autres procédés, notamment l'utilisation d'analogues d'acides aminés modifiés, tels que l'analogue de la méthionine L-azidohomoalaine (AHA), couplé à la chimie 30 "cliquable", ont été utilisés pour montrer que les cellules contenant des SG présentent une traduction beaucoup plus faible que les cellules voisines 31 . Cependant, cette technique nécessite une famine de méthionine suivie d'un étiquetage des impulsions pendant 15 à 30 minutes. La famine de la méthionine constitue un stress supplémentaire, tandis que le temps d'étiquetage long ( c'est- à -dire 15-30 min) aboutit à la mesure de la traduction cumulative plutôt que continue et permet également aux protéines nouvellement synthétisées de passer de leur site de synthèse à leur destination finale cellule. En revanche, la ribopuromycylation est beaucoup plus rapide et compatible avec n'importe quel milieu, comme le milieu sans glucose utilisé pour induire des SG à cause de la famine du glucose.
Les SG canoniques sont en équilibre dynamiqueAvec la traduction active de polysomes. Ceci peut être évalué expérimentalement en traitant des échantillons avec les médicaments qui stabilisent ou déstabilisent les polysomes, réduisant ainsi l'équilibre entre les SG et les polysomes 23 . Le cycloheximide (ou l'emetine, qui se comporte de la même manière) bloque l'allongement par la «congélation» des ribosomes sur l'ARNm, diminuant ainsi le pool de mRNP non polysomaux disponibles pouvant former des SG. D'une manière expérimentale, cela peut être utilisé de deux façons: en ajoutant du cycloheximide (ou de l'emetine) avant le stress pour éviter la formation de SG ou en ajoutant du cycloheximide (ou de l'emetine) après la formation des SG, même sans enlever l'agent contraignant, provoquant le désassemblage du SG, comme paralysé Des complexes de préinitiation sont admis lentement dans la fraction de polysome. En revanche, la puromycine provoque une terminaison prématurée et favorise le désassemblage des polysomes, ce qui augmente le nombre d'ARNm initiateurs capables de se constituer en SG. Expérimentalement, le traitement par la puromycine augmente le nombre de SG ou abaisse le thresholD à laquelle ils se forment en réponse à un stress gradué ou à un dosage médicamenteux. Lors de l'évaluation de l'effet de la puromycine, il est important d'utiliser un niveau sous-maximal de la drogue d'intérêt, car on s'attend à ce que la puromycine augmente l'effet du médicament et augmente le pourcentage de cellules présentant des SG – cela ne peut pas se produire si le médicament / Stress provoque des SG dans 100% des cellules initialement. Cela contraste avec le traitement par cycloheximide, qui désassemble les SG et fonctionne mieux lorsque ~ 95% des cellules présentent initialement des SG afin que la plus grande diminution possible puisse être observée et quantifiée avec précision.
Ce protocole fournit un cadre pour étudier les SG dans les cellules de mammifères. Les méthodes comprennent: (1) la coloration immunofluorescente et l'analyse de l'imageJ pour évaluer la colocalisation des marqueurs classiques associés au SG eIF4G, eIF3b et la protéine liant les protéines activant Ras GTPase 1 (G3BP1) dans les SG putatifs; (2) l'hybridation in situ par fluorescence oligo (dT) (polyA FISH) pour détecter l'ARNm polyadénylé; (3) le traitement par cycloheximide et puromycine pour déterminer si les foyers induits par le stress sont en équilibre dynamique avec les polysomes; Et (4) la ribopuromycylation pour évaluer l'état de translation des cellules contenant des SG putatifs. Ensemble, ces analyses peuvent déterminer si les foyers induits par le stress peuvent être classés comme SG de bonne foi .
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme en témoignent les études immunohistologiques dans de multiples maladies, le stress chronique conduit à la formation de différents foyers intracellulaires. Par exemple, la plupart des maladies neurodégénératives sont caractérisées par des agrégats intracellulaires de protéines insolubles. La présence de protéines associées à SG dans de tels agrégats est souvent la base pour conclure que ces foyers sont des SG. Une conclusion similaire est également établie lorsque des foctes cytoplasmiques positiv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres des laboratoires Ivanov et Anderson pour leur discussion utile et leurs commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé [GM111700 et CA168872 à PA, NS094918 à PI], le Centre national des sciences en Pologne [accorder UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 à WS]. WS reconnaît également le ministère de la Science et de l'Enseignement supérieur en Pologne (Programme Mobility Plus) et la Commission Fulbright polonaise-américaine pour leur soutien financier à ses recherches aux États-Unis.
Materials
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | – commonly written as "U2OS" – culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | – abbreviated DMEM – contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red – supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin – prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442-500ml | – abbreviated FBS – used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | – used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | – used to supplement media |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues | KIMTECH SCIENCE | 34120 | – commonly called "kimwipes" |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | – autoclaved before used – keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% | Sigma | S7400-100G | – commonly called sodium arsenite and abbreviated SA – dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine | TSZ CHEM | RS055 | – abbreviated VRB – dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | – used to assess translation level (ribopuromycylation) – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | – used in combination with puro to assess general translation level – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide | Sigma | C4859 | – abbreviated CHX – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza / VWR | 95042-486 | – abbreviated PBS – wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline | Sigma | P6148-500G | – make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved – aliquots can be stored at – 20 °C for several months – hazardous, use ventilation – discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | – pre-chilled to -20°C before use – discard in special waste |
| Normal Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 31874 | – abbreviated NHS – dilute to 5% in PBS – add sodium azide for storage at 4°C – blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | – dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | – store at 4 °C – use at 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | – eIF3η is also known as eIF3b – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | – store at 4 °C – 1/1000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/2500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | – incubate with secondary antibodies -stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light – Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions, then store at 4°C – 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | – reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20°C – dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use – custom order |
| hybridation box | / | / | – make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom – prewarm the box prior use |
| 20 x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | – dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) – store at room temperature – wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | – block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | – mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS – mix by sonication, followed by stirring overnight at RT – Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT – centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet – aliquot viscous liquid, long-term storage at -20°C, 1 week at 4°C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | – usually referred as "parafilm" |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | – reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | – reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | – preservative agent for blocking solution and vinol – make a 20 % dilution in water |
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