שיטה לבחינת ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ב<em> תסיסנית מלנוגאסטר</em
Summary
אנו מדגימים assay לנתח את רמזים סביבתיים וגנטיים המשפיעים על התנהגות ההזדווגות של זבוב הפירות תסיסנית melanogaster .
Abstract
הדחף המיני של האדם מושפע מגנוטיפ, מניסיון ותנאי סביבה. איך גורמים אלה אינטראקציה כדי לווסת התנהגויות מיניות נשאר מובן. ב תסיסנית melanogaster , רמזים סביבתיים, כגון זמינות מזון, משפיעים על פעילות ההזדווגות המציע מערכת דקדנית לחקור את מנגנונים modulating מינית התנהגות. ב ד melanogaster , רמזים סביבתיים הם חשו לעתים קרובות באמצעות chemosensory gustatory ומערכות חוש הריח. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את ההשפעה של רמזים כימיים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות. Assay מורכב הזירה הזדווגות קטן המכיל בינוני מזון זוג מזדווגים. תדירות ההזדווגות עבור כל זוג הוא פיקוח מתמיד במשך 24 שעות. כאן אנו מציגים את תחולת assay זה כדי לבדוק תרכובות סביבתיות ממקור חיצוני באמצעות מערכת אוויר דחוס כמו גם מניפולציה של רכיבים סביבתיים ישירות בזירה ההזדווגות. USe של מערכת האוויר בלחץ שימושי במיוחד כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נדיפים מאוד, תוך מניפולציה רכיבים ישירות בזירה ההזדווגות יכול להיות בעל ערך כדי לוודא נוכחות של המתחם. Assay זה יכול להיות מותאם לענות על שאלות לגבי ההשפעה של רמזים גנטיים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ואת פוריות, כמו גם אחרים התנהגות הרבייה זכר ונקבה.
Introduction
התנהגויות פוריות בדרך כלל יש עלויות אנרגיה גבוהות, במיוחד עבור הנקבות, אשר מייצרים gametes גדול יותר מאשר גברים חייב בזהירות בחר את התנאים להעלות את צאצאיהם המתפתחים. בגלל עלות האנרגיה, אין זה מפתיע כי רבייה קשורה לתנאים תזונתיים. זה נכון ברוב, אם לא כל, חיות כולל יונקים, התבגרות אשר יכול להתעכב על ידי תת תזונה, ואשר דחף מיני יכול להיות מושפעת לרעה על ידי מזון הגבלה 1.
רפרודוקציה של אורגניזם מודל גנטי תסיסנית melanogaster מושפע גם בתנאים תזונתיים. גברים בבית המשפט ברמה גבוהה יותר בנוכחות מזון נדיפים 2 , ונקבה הם יותר מינית פתוח בנוכחות שמרים, מזין עיקרי לייצור ביצים וצאצאים הישרדות 3 , 4 , 5 . זֶהאבולוציונית משמרת התגובה הרבייה למזון מציעה הזדמנות ללמוד מנגנונים המחברים זמינות מזון סביבתי כדי רבייה מינית באורגניזם גנטית זמן יעיל. ואכן, עבודה ד melanogaster יש מעורבים את מסלול האינסולין כווסת חשוב של הקשר בין מזון התנהגות ההזדווגות 6 . זה הוכיח גם כי מעשה ההזדווגות עצמו משנה את העדפת המזון של הנקבות, כמו גם את הנוירונים chemosensory הקשורים 7 , 8 , 9 .
ברור כי רמזים למזון משפיעים על התנהגויות הרבייה ב מלנוגאסטר . תופעות אלה נראים משפיעים בעיקר נשים, במיוחד לאלה שכבר הזדווגו 5. עם זאת, כדי לבדוק את ההשפעות האלה חריפה של תנאים סביבתיים assay בשימוש קלאסי עבור התנהגות ההזדווגות הנשי עשוילא להיות מתאים מאוד עקב הפרעות ארוכות בין פרקים ההזדווגות. ב assay remating קלאסי, נקבה בתולה הראשון mates עם זכר, והוא מבודד מיד ומוצג עם זכר חדש 24 עד 48 שעות מאוחר יותר. זה assay קלאסי שימש בהצלחה רבה כדי לזהות רכיבים של פליטה זכר לשנות את ההתנהגות הנשית ואת התגובה הנשית 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Assay ההזדווגות מתמשך הוכיח כאן, ולכן, בנוסף מבחני ההזדווגות הקלאסית שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההשפעה החריפה של תנאים סביבתיים על התנהגויות הרבייה.
באמצעות assay מתמשך עבור התנהגות ההזדווגות מוסבר כאן, הראינו בעבר כי זוג זבובים חשופים שמרים יהיה remate sאי פעם על פני תקופת תצפית של 24 שעות 5 , 19 , 20 , 21 , בעוד זבובים לא חשופים למזון יהיה רק פעם אחת 5 . ממצא זה יכול להיות תמוהה לאור חלק גדול של הספרות ד melanogaster המציין כי הנקבות לא remate עבור מספר ימים לאחר הזדווגות הראשונית (נסקרו הפניות 10 , 11 ). עם זאת, פער זה יכול בקלות להיות מוסבר על ידי תנאי assay, שבו נקבה מבודדת במשך יום עד כמה ימים לפני הזדמנות ההזדווגות החדשה מסופק. אם הצמד אינו מזדווג במהלך תקופת תצפית זו של שעה, הנקבה מאופיינת כבלתי פתוחה. יתר על כן, תדירות ההזדווגות גבוהה לא צריך להיות מפתיע בהתחשב בנתונים של זבובים נתפס בר להראות כי הנקבות מכילות זרע מ 4 עד 6 זכרים באברי האחסון שלהם; ובכךDicating כי הנקבות באופן טבעי remate מספר פעמים 22 , 23 .
כאן, אנו מדגימים את השימוש זה assay הזדווגות מתמשך כדי לפענח כיצד זבובים לאסוף ולשלב מידע על תנאי הסביבה כדי לווסת את תדירות ההזדווגות. Assay זה מאפשר אחד לבחון מספר גדול יחסית של זוגות ההזדווגות עבור מחקרים גנטיים כדי לבדוק את ההשפעה של רמזים סביבתיים נדיפים ולא תנודתיים. Assay בדרך כלל פועל במשך 24 שעות, אבל יכול להיות המורחבת ל 48 שעות, המאפשר בדיקה של רמזים סביבתיים רכיבה כגון מחזור כהה (LD) אור. אנו מדגימים assay זה על ידי בדיקת ההשפעה של רמזים נדיפים מתרבות שמרים בתוך מערכת אוויר בלחץ בשילוב עם הזמינות של מזין שמרים בלתי נדיף מצע מזון.
מערכת האוויר בלחץ ברציפות משאבות רמזים נדיפים לזירת ההזדווגות המכיליםמזון מצע זוג הבדיקה (אשר התנהגות ההזדווגות שלו מנוטר). כדי לקבוע עוד יותר את הפרטים באמצעותם השמרים משפיע על ההזדווגות, אנו בוחנים תרכובת נדיפה גדולה של שמרים, כלומר חומצה אצטית 24 , בשילוב עם חומצת אמינו תוכן המתאים לזה של שמרים במצע מזון, בצורה של פפטון (אמינו חומצות הנובעות מעיכול אנזימטי של חלבונים מן החי). יחד אלה ניסויים להדגים כיצד ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות של ד melanogaster ניתן לבדוק עם assay זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר assay כדי לבדוק התנהגות ההזדווגות מעל 24 שעות תוך שליטה רציפה על רמזים סביבתיים כי זוג הזדווגות משוער להשתמש כדי לקבוע תדירות ההזדווגות. ניתן להגדיל את תדירות ההזדווגות בתגובה האוויר שמרים נמסר באמצעות מערכת אוויר בלחץ כאשר המדיום מכיל שמרים גם ( א?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז המניות של בלומינגטון תסיסנית עבור המניות זבוב; ג גאהר, ג 'ט Alkema, ו S. ואן Hasselt על הניסיון המוקדם שלהם בפיתוח assay האוויר בלחץ; ג 'ספר בוסמן על העצה על טיפוח שמרים; ואת רזה Athanchi ואת יואל לוין עבור במקור לפתח את זמן לשגות ניטור של תסיסנית הזדווגות התנהגות. JA Gorter נתמך על ידי מעבדה מחקר מדעי המוח BCN / NWO מענק תוכנית. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) (הפניה: 821.02.020) ל- JC Billeter.
Materials
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
