Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

Résumé

Cette procédure décrit comment lancer rapidement, étendre et connecter des neurites organisées dans des chambres microfluidiques en utilisant des billes revêtues de poly-D-lysine fixées sur des micropipettes qui guident l'allongement des neurites.

Résumé

Les lésions du cerveau et de la moelle épinière peuvent conduire à un handicap permanent et à la mort car il n'est toujours pas possible de régénérer les neurones sur de longues distances et de les reconnecter avec précision à une cible appropriée. Ici, une procédure est décrite pour lancer rapidement, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Les taux d'extension atteints atteignent plus de 1,2 mm / h, 30 à 60 fois plus vite que les taux in vivo des axones à plus forte croissance du système nerveux périphérique (0,02 à 0,04 mm / h) ²⁸ et 10 fois plus rapides que précédemment signalés pour le même Type neuronal à un stade de développement antérieur ⁴ . Premièrement, les populations isolées de neurones d'hippocampe de rat sont cultivées pendant 2-3 semaines dans des dispositifs microfluidiques pour positionner précisément les cellules, ce qui permet une micromanipulation facile et une reproductibilité expérimentale. Ensuite, les perles recouvertes de poly-D-lysine (PDL) sont placées sur des neurites pour former un conteneur adhésifLes actes et la micromanipulation par pipette sont utilisés pour déplacer le complexe résultant de neurites-perles. À mesure que le cordon est déplacé, il élimine un nouveau neurite qui peut être étendu sur des centaines de micromètres et connecté fonctionnellement à une cellule cible en moins de 1 h. Ce processus permet une reproductibilité expérimentale et une facilité de manipulation tout en contournant des stratégies chimiques plus lentes pour induire une croissance des neurites. Les mesures préliminaires présentées ici démontrent un taux de croissance neuronal dépassant largement les facteurs physiologiques. La combinaison de ces innovations permet l'établissement précis de réseaux neuronaux en culture avec un degré de contrôle sans précédent. C'est une méthode novatrice qui ouvre la porte à une multitude d'informations et d'informations sur la transmission et la communication du signal dans le réseau neuronal, tout en étant une aire de jeux pour explorer les limites de la croissance neuronale. Les applications et expériences potentielles sont répandues avec des implications directes pour les thérapies qui visent à reconnecter les neuronesL après un traumatisme ou dans des maladies neurodégénératives.

Introduction

Les blessures au système nerveux central adulte (SNC) peuvent entraîner un handicap permanent en raison de mécanismes multiples qui limitent la repousse axonale ¹ . Après une blessure, de nombreux axones CNS ne forment pas un nouveau cône de croissance et ne parviennent pas à monter une réponse régénératrice efficace ² . En outre, les dommages et les tissus cicatriciels entourant les lésions du SNC inhibent de manière significative la croissance axonale ^{1 , 2 , 3} . Les thérapies actuelles pour favoriser la régénération du SNC a....

Protocole

Toutes les procédures détaillées ci-dessous ont été approuvées par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et sont conformes aux lignes directrices du Conseil canadien des soins animaux.

1. Normalisation des cultures neuronales à l'aide de dispositifs microfluidiques: assemblage de périphériques

1. Sélectionnez un périphérique microfluidique approprié pour l'expérience souhaitée. Pour connecter les neurones au sein d'une même population, utilisez Neuro Devices ( Figure 1 ) et pour connecter les neurones dans différentes populations, utilisez les Dispositifs de Co-Culture ( <....

Résultats

Les neurones hippocampiques du rat embryonnaire sont cultivés dans des dispositifs microfluidiques pour permettre un positionnement précis des cellules, des puces PDL et des micromanipulateurs. La première étape consiste à assembler correctement l'appareil microfluidique sur une lamelle ou un plat en verre. Il est essentiel que le dispositif microfluidique soit bien attaché au substrat pour éviter que les cellules quittent les chambres et ne se déplacent sous les parties du dispositi.......

Discussion

En utilisant une micromanipulation standard et des dispositifs microfluidiques innovants, une nouvelle technique a été développée pour initier, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de grandes distances. La micromanipulation par pipette est un outil commun dans la plupart des laboratoires de neurosciences ^{4 , 13} . Le véritable défi pour obtenir des résultats reproductibles et fiables était la normalisation de cu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dispositifs de co-culture	Ananda Devices		Disponible dans le commerce chez http://www.anandadevices.com
Dispositifs neurologiques	Ananda Devices		Disponible dans le commerce chez http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round	Warner Instruments	64-0705
35 mm Plats à fond en verre #0, non revêtus, irradiés aux rayons gamma	MatTex Incorporation	P35G-0-20-C
Boîte de culture cellulaire de 35 mm, apyrogène, stérile	Corning Inc	430165 boîte de
Pétri de 95 mm x 15 mm, couvercle coulissant, polystyrène stérile	Fisherbrand	FB0875714G
50 mL Tubes à centrifuger avec graduations imprimées et bouchons plats	VWR	89039-656
Tube conique en polypropylène de 15 mL, style 17 x 120 mm, apyrogène,	faucon stérile
Neurobasal Medium Life	Technologies	21103-049	Solution extracellulaire
B-27 Supplément (50X),	supplément B-27 sans sérum (50X), sérum sans 17504044		Solution extracellulaire
Penniciline, streptomyocine, glutamine	Thermo Fisher Scientific  ;	11995-065	Solution extracellulaire
200 &mu ; L Pipettors	VWR	89079-458
2 - 20 &mu ; L Pipettors	Embouts Résistants aux Aérosols	2149P
BD Falcon 3mL Pipettes de Transfert [Non Stériles]	BD Falcon	357524
Glucose	Gibco	15023-021	Solution extracellulaire
HEPES	Sigma	7365-45-9	Solution extracellulaire/Perles
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	Solution extracellulaire
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Solution extracellulaire
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Solution extracellulaire
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Solution extracellulaire
#5 Dumont Dumostar Pince à épiler 11 cm	World Precision Instruments	500233
Outils de dissection	Braun, Aesculap
Poly-D-lysine Hydrobromure	Sigma-Aldrich	P6407
Microparticules à base de polystyrène, 10 &mu ; m	Sigma-Aldrich	72986
Tubes borosilicatés	King Precision Glass, Inc.	14696-2
Extracteur de pipette horizontal	Sutter Instruments	Micromanipulateurs P-97
, série PCS-5000	Instruments SD	MC7600R
1 mL Seringue	BD Luer-Lok	309628
Microscope inversé	Olympus  ;	IX71
Objectif	Olympus	UIS2, LUCPLFLN 40X
Caméra CCD	Photométrie	Cascade II : 512
Leibovitz (1x) L-15 Medium	Life Technologies	11415-064	Dissection
rats Typsin-EDTA (0,05 %), Phenol red	Life Technologies	25300054	Dissection
de ratsDMEM (1x) Dulbecco’s Modified Eagle Medium [+4,5 g/L de D-glucose, + L-glutamine, + 110 mg/L de pyruvate de sodium]	Life Technologies	11995-065	Dissection de rats
HBSS (1x) Hank’s Balanced Salt Solution [- Chlorure de calcium, - Chlorure de magnésium, - Sulfate de magnésium]	Life Technologies	14170-112	Dissection de rats

352097à flamme brune de