Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Summary

Trasporto ionico cellulare spesso può essere valutata attraverso il monitoraggio pH intracellulare (pH_ho). Geneticamente codificato indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH intracellulare in cellule intatte. Questo protocollo dettaglia la quantificazione del pH intracellulare attraverso cellulare ex vivo live-immagini di tubuli malpighiani di Drosophila melanogaster con Bud, un pseudo-raziometrici geneticamente codificato indicatore di pH.

Abstract

Trasporto ionico epiteliale è vitale per omeostasi ionica sistemica così come manutenzione dei gradienti elettrochimici cellulari essenziali. PH intracellulare (pH_io) è influenzato da molti trasportatori di ioni e quindi monitoraggio pH_mi è uno strumento utile per la valutazione dell’attività di trasportatore. Moderno geneticamente codificato-indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH in cellule intatte su scala cellulare e subcellulare. Questo protocollo descrive la quantificazione in tempo reale del pH cellulare_ho regolamento in tubuli malpighiani (MTs) di Drosophila melanogaster attraverso ex vivo live-immagini di Bud, una pseudo-raziometrici GEpHI con un pK_un adatto per tenere traccia di variazioni di pH nel citosol. Estratto Mosca adulta MTs sono composte da sezioni morfologicamente e funzionalmente distinte del epithelia strato unicellulare e può servire come un modello accessibile e geneticamente trattabile per indagine di trasporto epiteliale. GEpHIs offrono parecchi vantaggi sopra le tinture fluorescenti convenzionali pH sensibili ed elettrodi iono-selettivi. GEpHIs possibile etichettare popolazioni distinte delle cellule, purché gli elementi appropriati promotore sono disponibili. Questa marcatura è particolarmente utile nelle ex vivo, in vivoe in situ preparati, che sono intrinsecamente eterogenei. GEpHIs consentono anche la quantificazione del pH_i nei tessuti intatti nel tempo senza necessità di esternalizzazione di trattamento o tessuto di tintura ripetute. Lo svantaggio principale del GEpHIs corrente è la tendenza ad aggregare nelle inclusioni citosoliche in risposta al danno tissutale e costruire la sovra-espressione. Queste carenze, loro soluzioni e vantaggi che essi GEpHIs vengono illustrati nel presente protocollo attraverso la valutazione del trasporto di protoni (H⁺) basolateral nelle cellule principali e stellari funzionalmente distinte di estratti fly MTs. Le tecniche e l’analisi descritta sono facilmente adattabile ad un’ampia varietà di preparazioni di vertebrati e invertebrati, e la raffinatezza del dosaggio può essere scalata da laboratori intricato determinazione del flusso ionico attraverso specifici trasportatori didattici.

Introduction

L’obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere la quantificazione del pH intracellulare (pH_i) utilizzando un geneticamente codificato-indicatore di pH (GEpHI) e dimostrare come questo metodo può essere utilizzato per valutare basolaterale trasporto di H⁺ in un insetto di modello (D. melanogaster) struttura renale, l’anatomista (MT). MTs servire come gli organi escretori del moscerino della frutta e sono simili ai mammiferi nefrone in diversi aspetti chiave¹. MTs sono disposti come 2 paia di tubuli (anteriori e posteriori) nel torace e l’addome della Mosca. Il tubo epiteliale unicellulare di ogni MT è composto di cellule principali metabolicamente attive con la clausola distinct apicale (luminal) e basolaterale (emocele) polarità come pure intercalate cellule stellate. MTs anteriore sono composti da 3 morfologicamente, funzionalmente, ed inerente allo sviluppo distinti segmenti, in particolare l’iniziale dilatati segmento e segmento di transizione secretiva segmento principale, che si unisce all’ uretere². A livello cellulare trasporto trans-epiteliale ionico nel lumen è compiuto da una membrana plasmatica apicale del V-ATPasi³ e uno scambiatore di alcali-metallo/H⁺ , nonché un basolateral Na⁺-K⁺-ATPasi⁴, verso l’interno-raddrizzatore K⁺ canali⁵, Na⁺-driven Cl⁻/HCO₃⁻ scambiatore (NDAE1)⁶e Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69),⁷, mentre le cellule stellate mediano Cl^– e acqua di trasporto^8,9. Questo sistema fisiologico complesso ma accessibile offre eccellenti opportunità per indagine dei meccanismi di trasporto di ioni endogeni quando combinato con i diversi set di strumenti genetici e comportamentali di Drosophila.

La spiegazione razionale per questo protocollo era di descrivere un sistema geneticamente malleabile per studiare il trasporto ionico epiteliale con un potenziale di integrazione da cella a comportamento e l’esportazione di strumenti ad altri sistemi di modello. Espressione di Bud¹⁰, un GEpHI derivato da una fusione di verde pH sensibili Super-eclittica pHluorin^11,12 (SEpH) e rosso mCherry pH-insensibile¹³, in MTs permette quantificazione di trasporto H⁺ in celluli MT attraverso la tecnica di calibrazione /nigericin alta K⁺¹⁴. Come molti trasportatori di ioni spostano equivalenti di H⁺ , quantificazione del pH intracellulare funge da rappresentazione funzionale del movimento di ioni attraverso una varietà di trasportatori. Il sistema di modello di Drosophila MT offre anche potenti strumenti genetici in tessuto-specifico transgene¹⁵ ed espressione di RNA interferenza (RNAi)¹⁶ , che può essere combinato con imaging cellulare e intero-organo saggi^{17 , 18 , 19} della funzione del tubulo per creare un robusto set di strumenti con integrazione verticale da molecole di comportamento. Questo è in contrasto con molti altri protocolli per la valutazione biologia epiteliale, come storicamente tali misure hanno contato su intricati e scoraggiante micro-dissezione, sofisticato elettrodi iono-selettivi^20,21, e costosi pH sensibili coloranti²² con richieste di caricamento restrittive e scarsa specificità cellulare nei tessuti eterogenei. GEpHIs sono stati utilizzati estesamente misurare pH_sono in una varietà di tipi di cella²³. Primi lavori sfruttati la pH-sensibilità intrinseca di verde fluorescente Protein (GFP) per monitorare il pH in cellule epiteliali coltivate²⁴ , ma negli ultimi due decenni hanno visto GEpHIs utilizzato in neuroni²⁵, glia²⁶, funghi²⁷ , e pianta cellule²⁸. La combinazione del potenziale per il targeting cellulari di costrutti genetici attraverso il sistema di espressione GAL4/UAS¹⁵ e l’accessibilità al fisiologico della drosofila MT rendono questo una preparazione ideale per indagini di pH_ho regolamento e trasporto ionico epiteliale.

regolazione del pH è stato studiato per decenni ed è vitale alla vita. La preparazione di MT offre un modello affidabile per insegnare la fisiologia della regolazione del pH_ho ma anche eseguire sofisticate indagini di pH_i regolamento ex vivo e in vivo. Questo protocollo descrive la quantificazione del movimento H⁺ attraverso la membrana basolaterale delle cellule epiteliali di Drosophila MT utilizzando il NH₄caricamento tecnica²¹acido di impulso di Cl, ma come l’indicatore di pH è geneticamente codificato, questi metodi e loro quadro teorico può essere applicati a qualsiasi preparazione suscettibili di transgenesi e live-imaging.

Protocol

Tutti i punti in questo protocollo conformi alle linee guida uso animale Mayo Clinic (Rochester, MN). 1. allevamento di volare Vola di rilancio e insieme traverse secondo standard allevamento29.Nota: Espressione di reporter fluorescente dal sistema GAL4/UAS è proporzionale alla temperatura e quindi allevamento temperatura può essere regolata per modificare il livello di espressione. Mentre i livelli di espressione alta conducono spesso ad un migliore rap…

Representative Results

Tessuti sani e un’adeguata identificazione del MTs anteriore sono vitali per il successo del presente protocollo. Durante la dissezione, dovrebbe prestare attenzione a non direttamente tocco il MTs e maniglia unica loro dall’uretere come la MTs di presa direttamente porterà alla rottura (Figura 4A– B). Quando MTs sono spazzate piatta sulla diapositiva, i tubuli devono essere toccati il meno possibile e movimento in eccess…

Discussion

Il successo di quantificazione del pH_sono de Drosophila MTs dipende interamente sulla salute degli estratti MTs e la qualità del montaggio e la dissezione (Figura A – C). Così, la gestione attenta del tessuto come descritto è imperativa. Diapositive appena rivestiti in PLL sostanzialmente aiuti MT di montaggio, come essi tendono ad essere molto più adesivo di diapositive che precedentemente sono stati esposti alla soluzione. Montaggio attenzio…

Materials

Poly-L-Lysine Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.