Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra
Summary
Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia.
Abstract
Aqui, apresentamos um novo sistema de indução de hipoxia, que desenvolvemos para estudar os efeitos da hipóxia em organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema compreende uma câmara com uma configuração simples que, no entanto, é robusta para induzir e manter uma concentração específica de oxigênio e temperatura em qualquer solução experimental de escolha. O sistema apresentado é muito econômico, mas altamente funcional, permite a indução e sustentação da hipoxia para experiências diretas in vivo e por vários períodos de tempo até 48 h.
Para monitorar e estudar os efeitos da hipóxia, empregamos dois métodos – aferição de níveis de fator 1alpha (HIF-1α) induzível por hipoxia em embriões inteiros ou tecidos específicos e determinação da proliferação de células estaminais da retina por 5-etinil-2'- Incorporação de desoxiuridina (EdU) no DNA. Os níveis de HIF-1α podem servir como marcador de hipoxia geral em todo o embrião ou tecidoDe escolha, aqui retina embrionária. A incorporação de EdU nas células de proliferação da retina embrionária é uma produção específica de indução de hipoxia. Assim, mostramos que os progenitores de retina embrionária hipóxica diminuem a proliferação dentro de 1 h de incubação sob 5% de oxigênio de embriões de sapo e zebrafish.
Uma vez dominado, nossa configuração pode ser empregada para uso com pequenos organismos modelo aquáticos, para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob concentração de oxigênio normal, hipóxica ou hiperóxica ou sob qualquer outra mistura de gás.
Introduction
A pesquisa de hipoxia tem inúmeras aplicações. Estes incluem a investigação da patogênese e o desenvolvimento de tratamentos para condições médicas caracterizadas por hipoxia 1 e doença aguda de alta altitude 2 . O estresse hipóxico causa grandes alterações metabólicas em todos os organismos que necessitam de oxigênio. O estresse hipóxico também influencia o crescimento e desenvolvimento fetal e a patogênese de várias doenças humanas, incluindo a restrição do crescimento intra-uterino 3 . O estresse hipoxico não só pode levar a um menor peso ao nascer, mortalidade fetal e neonatal, mas também pode resultar em muitas complicações na vida adulta, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, obesidade e hipertensão 4 . O estresse hipóxico também é freqüentemente observado durante o desenvolvimento de tumor sólido, quando o tecido tumoral ultrapassa o suprimento de sangue. Por conseguinte, é crucial poder estudar os efeitos da hipóxia in vivo e directamente durante o embrião Desenvolvimento yônico.
Entre os métodos mais bem conhecidos que foram empregados para estudar os efeitos da hipoxia durante o desenvolvimento é o uso de cloreto de cobalto no meio de crescimento ou a incubação do organismo em uma câmara hipóxica. O cloreto de cobalto induz artificialmente uma resposta hipóxica sob a concentração normal de oxigênio, devido ao seu papel na estabilização do alfa de factor 1 induzível pela hipoxia (HIF-1a), prevenindo sua degradação proteossômica 5 , 6 , 7 . No entanto, sendo um método conveniente 8 , o uso de cloreto de cobalto, bem como outros miméticos de hipóxia química semelhantes, podem ter efeito deletério inespecífico sobre células e tecidos, por exemplo , apoptose 9 . Portanto, as câmaras hipóxicas são um método melhor para a indução de "hipoxia natural" em organismos vivos ao longo do desenvolvimento normal.
Nós nos concentramos no desenvolvimento de um sistema de indução de hipoxia em embriões de animais aquáticos, tanto os sapos quanto o peixe-zebra tornaram-se organismos modelo informativos de vertebrados para estudos de numerosos processos biológicos, bem como modelos para várias doenças humanas. Embriões de sapo e zebra Desenvolver externamente, eliminando a complicação da compensação materna. Além disso, um rápido processo de desenvolvimento permite manipular fatores ambientais e observar as mudanças fenotípicas na formação de órgãos em tempo real. Além disso, muitos componentes das principais direções de transdução de sinal são altamente conservados em Esses organismos modelo e foram caracterizados em detalhes por uma grande quantidade de literatura. A principal vantagem no uso de sapos e embriões de peixe-zebra para estudar os efeitos da hipóxia no desenvolvimento de vertebrados é que todos os processos podem ser monitorados diretamente, já que o oxigênio penetra rapidamente nos embriões. Assim, em sapos e peixe-zebra, como em contraste com outros organismos modelo, comoEmbriões de camundongo, a influência de uma concentração específica de oxigênio pode ser estudada no tecido de interesse, sem levar em consideração a presença ou falta de vasculatura funcional.A maioria das configurações comercialmente disponíveis para incubação hipóxica tem a desvantagem de ser comparativamente grande e ter custos de funcionamento correspondentemente elevados. Além de seu alto custo inicial e consumo de gás, equilíbrio e manutenção de câmaras de hipoxia comuns requer manutenção de atmosfera hipoxica constante contra o gradiente de gás que ocorre naturalmente nestas câmaras devido ao seu maior tamanho e / ou respiração do organismo. Isso requer emprego de ventiladores de gás e um sistema de resfriamento, o que aumenta a quantidade de equipamentos necessários adicionais, impede a destreza do pesquisador e diminui a simplicidade do procedimento experimental. Em contraste, a configuração que apresentamos aqui é comparativamente robusta, mas muito econômica, pequena, fácil de estabelecer e permite que fEquilíbrio de gás, atmosfera hipóxica estável e troca simples de materiais e soluções dentro da câmara. Nosso sistema pode ser empregado para uso com qualquer organismo modelo aquático de interesse.
Nós construímos uma câmara hipóxica que é convenientemente pequena e, portanto, pode ser colocada dentro de uma incubadora comum de laboratório, que permite facilmente procedimentos experimentais a qualquer temperatura específica. Fornecer um controle conveniente da temperatura, bem como a concentração de oxigênio no meio, a vantagem do nosso sistema contra as incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis reside no seu pequeno tamanho e eficiência de custos. Assim, nossa configuração pode ser estabelecida usando suprimentos laboratoriais gerais disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa e não exige materiais caros. Além disso, nossa configuração não gera calor, ao contrário das incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis, e permite o uso a temperaturas inferiores à temperatura ambiente colocadas em uma incubadora. A laSt é especialmente crítico para o trabalho com organismos de sangue frio, como sapos e peixes, onde as taxas de desenvolvimento e metabólicas são fortemente dependentes da temperatura.
Sendo muito rentável e facilmente construído, a nossa câmara de incubação de gás é, no entanto, muito versátil no estabelecimento de várias condições hipóxicas ou hiperóxicas, além de permitir uma administração rápida e fácil de diferentes meios e soluções para uma grande quantidade de condições experimentais. Além disso, empregando uma placa de 24 poços em vez de pratos comumente usados ou tanques de laboratório 10 , 11 , 12 , nosso sistema permite a observação e tratamento experimental de várias condições mutantes ao mesmo tempo.
Para controlar a indução correta de hipoxia, monitoramos os níveis da proteína HIF-1a por detecção de Western Blot. Além disso, o número de células que proliferam antes e depois da incubaçãoN na câmara hipóxica pode ser usado para determinar se a hipóxia foi induzida no tecido. Este método baseia-se nos resultados publicados anteriormente 13 , mostrando que a proliferação no nicho das células-tronco da retina embrionária diminui após a indução da hipoxia. Assim, monitorizamos o nível de proliferação de células estaminais da retina por adição de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) ao meio embrionário e medindo sua incorporação no DNA de células que proliferam recentemente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos um novo método fácil, mas robusto, para induzir hipoxia que é ajustada para uso com embriões de sapo e zebra, mas também pode ser adequada para outros organismos aquáticos. A principal vantagem deste método reside na sua simplicidade e eficiência de custos. No entanto, os resultados obtidos com este método são muito robustos. Mostramos que a hipoxia pode ser induzida eficientemente na câmara tanto em embriões inteiros quanto em tecido específico – aqui, retinas. Para determinar a eficácia…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo apoio do Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e a bolsa DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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