Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Summary

Vi introducerer et nyt hypoxisk kammersystem til brug sammen med vandorganismer som frog og zebrafish embryoner. Vores system er enkelt, robust, omkostningseffektivt og muliggør induktion og vedligeholdelse af hypoxi in vivo og i op til 48 timer. Vi præsenterer 2 reproducerbare metoder til overvågning af effektiviteten af ​​hypoxi.

Abstract

Her introducerer vi et nyt system til hypoxi induktion, som vi udviklede til at studere hypoxiets virkninger i vandlevende organismer som frog og zebrafish embryoner. Vores system består af et kammer med en simpel opsætning, som alligevel er robust til at fremkalde og opretholde en specifik iltkoncentration og -temperatur i en hvilken som helst forsøgsopløsning. Det præsenterede system er meget omkostningseffektivt men meget funktionelt, det tillader induktion og vedligeholdelse af hypoxi til direkte forsøg in vivo og i forskellige tidsperioder op til 48 timer.

For at overvåge og undersøge virkningerne af hypoxi har vi brugt to metoder – måling af niveauer af hypoxi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1α) i hele embryoner eller specifikke væv og bestemmelse af retinalt stamcelleproliferation med 5-ethynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA'et. HIF-1a niveauer kan tjene som en generel hypoxi markør i hele embryoet eller vævetEfter eget valg, her embryonalt nethinden. EdU inkorporering i de proliferative celler af embryonalt retina er en specifik udgang af hypoxi induktion. Således har vi vist, at hypoxiske embryonale retinale forfædre reducerer proliferation inden for 1 time inkubation under 5% oxygen af ​​både frø og zebrafiskembryoner.

Når vi har mestret, kan vores opsætning anvendes til brug med små vandmiljøorganismer, til direkte in vivo forsøg, en given tidsperiode og under normal, hypoxisk eller hyperoxisk iltkoncentration eller under en anden given gasblanding.

Introduction

Hypoxi forskning har mange anvendelser. Disse omfatter undersøgelse af patogenesen og udvikling af behandlinger for medicinske tilstande præget af hypoxi ¹ og akut højhøjde sygdom ² . Hypoksisk stress forårsager større metaboliske forandringer i alle organismer, der kræver ilt. Hypoksisk stress påvirker også fostervækst og udvikling og patogenesen af ​​adskillige humane sygdomme, herunder intrauterin vækstrestriktion ³ . Hypoksisk stress kan ikke kun føre til nedsat fødselsvægt, føtal og neonatal dødelighed, men kan også resultere i mange komplikationer i voksenlivet, såsom kardiovaskulær sygdom, type 2 diabetes, fedme og hypertension ⁴ . Hypoksisk stress observeres også ofte under udvikling af fast tumor, når tumorvævet vokser blodforsyningen. Det er derfor afgørende at kunne studere virkningerne af hypoxi in vivo og direkte under embr Yonisk udvikling.

Blandt de mest kendte metoder, som har været anvendt til at studere virkninger af hypoxi under udvikling, er brugen af ​​koboltchlorid i vækstmediet eller inkubation af organismen i et hypoxisk kammer. Cobaltchlorid inducerer kunstigt en hypoxisk reaktion under normal oxygenkoncentration på grund af sin rolle i stabiliseringen af ​​hypoxi-inducerbar faktor-1 alpha (HIF-1a) ved at forhindre dens proteosomal nedbrydning ^{5 , 6 , 7} . Imidlertid er anvendelsen af ​​koboltchlorid såvel som andre lignende kemiske hypoximimetika en uegnet, skadelig virkning på celler og væv, f.eks . Apoptose ⁹ , som en bekvem metode ⁸ . Derfor er hypoxiske kamre en bedre metode til induktion af "naturlig hypoxi" i levende organismer gennem normal udvikling.

Ntent "> Vi har fokuseret på at udvikle et system til induktion af hypoxi hos akvatiske embryoner. Både frøer og zebrafisk er nu blevet informative hvirveldyrmodellorganismer til studier af mange biologiske processer samt modeller for forskellige menneskelige sygdomme. Frog- og zebrafiskembryoner Udvikle eksternt, eliminere komplikationen af ​​maternisk kompensation. Et hurtigt udviklingsforløb gør det også muligt at manipulere miljøfaktorer og observere de fænotypiske ændringer i organdannelsen i realtid. Desuden er mange komponenter af de store signaltransduktionsveje stærkt bevaret i Disse modelorganismer og er blevet karakteriseret i detaljer af en stor mængde litteratur. Hovedfordelen ved at bruge frøer og zebrafiskembryoner til at undersøge virkningerne af hypoxi på udviklingen af ​​hvirveldyr er, at alle processer kan overvåges direkte, da oxygen hurtigt trænger ind i embryonerne. Således i frøer og zebrafisk, som i modsætning til andre modelorganismer som f.eksMusembryoer, kan indflydelsen af ​​en specifik iltkoncentration undersøges i det væv af interesse uden at tage hensyn til tilstedeværelsen eller manglen på funktionel vaskulatur.

De fleste kommercielt tilgængelige opsætninger til hypoxisk inkubation har den ulempe, at de er sammenligneligt store og har tilsvarende høje løbende omkostninger. Bortset fra deres høje indledende omkostninger og gasforbrug kræver ækvilibrering og vedligeholdelse af almindelige hypoxikamre en konstant hypoxisk atmosfære imod gasgradienten, som naturligt forekommer i disse kamre på grund af deres større størrelse og / eller organismernes åndedræt. Dette kræver ansættelse af gasfans og et kølesystem, hvilket øger mængden af ​​yderligere nødvendigt udstyr, forhindrer forskers fingerfærdighed og generelt reducerer enkelheden af ​​forsøgsproceduren. I modsætning hertil er opsætningen vi præsenterer her sammenligneligt robust, men meget omkostningseffektiv, lille, let at etablere og tillader fAst gas-ækvilibrering, stabil hypoxisk atmosfære og simpel udveksling af materialer og opløsninger inde i kammeret. Vores system kan anvendes til brug med enhver vandmiljøorganisme af interesse.

Vi har konstrueret et hypoxisk kammer, der er bekvemt lille, og kan derfor placeres inde i en fælles laboratorieinkubator, som let giver eksperimentelle procedurer til enhver bestemt temperatur. Fordelene ved vores system mod de kommercielt tilgængelige hypoxi-inkubatorer ligger bekvemt i kontrol med temperaturen såvel som iltkoncentrationen i mediet, idet den er lille størrelse og omkostningseffektivitet. Således kan vores opsætning etableres ved hjælp af generelle laboratorieforsyninger til rådighed for de fleste forskningslaboratorier og kræver ikke nogen dyre materialer. Derudover genererer vores opsætning ikke varme, i modsætning til de kommercielt tilgængelige hypoxi-inkubatorer, og tillader brug ved temperaturer, der er lavere end stuetemperatur, der anbringes i en inkubator. LaSt er særligt kritisk for arbejdet med koldblodede organismer som frøer og fisk, hvor udviklings- og metaboliske satser er stærkt temperaturafhængige.

At være meget omkostningseffektiv og let opbygget er vores gasinkubationskammer alligevel meget alsidigt ved etablering af forskellige hypoxiske eller hyperoxiske forhold samt mulighed for hurtig og nem administration af forskellige medier og løsninger til et stort antal eksperimentelle forhold. Derudover tillader vores system at anvende en brønd med 24 brønde i stedet for almindeligt anvendte tallerkener eller laboratorietanke ^{10 , 11 , 12} og observation og eksperimentel behandling af flere mutante forhold på én gang.

For at kontrollere for korrekt induktion af hypoxi har vi overvåget niveauerne af HIF-1a-proteinet ved Western blot-detektion. Derudover er antallet af proliferative celler før og efter inkubationN i det hypoksiske kammer kan bruges til at bestemme, om hypoxi er blevet induceret i vævet. Denne metode er baseret på vores tidligere offentliggjorte resultater ¹³ , der viser, at spredning i embryonal retinal stamcelle niche falder ved induktion af hypoxi. Således har vi overvåget niveauet af retinal stamcelleproliferation ved at tilsætte 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) til embryomediet og måle dets inkorporering i DNA'et af nyudbredende celler.

Protocol

Denne protokol følger dyresundhedsretningslinjerne fra University of Cambridge. 1. Dyrevedligeholdelse Frøembryoer BEMÆRK: Embryoer kan opdrættes og opretholdes i henhold til dyre- og laboratoriefaciliteten. Her er et eksempel på dyrvedligeholdelsen beskrevet. Forbered 0,1x modificeret Barths Solution (MBS) opløsning: 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHC03, 100 μM HEPES, 8,2 μM MgS04, 3,3 μM Ca (NO3) 2 og 4,1 μM CaCl2, pH 7,6 . Skaff <em…

Representative Results

Anvendelse af det hypoxiske kammersystem, som vi præsenterer her, gør det muligt at undersøge virkningerne af hypoxi individuelt og in vivo hos hele levende dyr. Hypoxi kan induceres ved at placere hele frø eller zebrafiskembryoner i det hypoksiske kammer ( Figur 1 ) og udføres på forskellige kombinationer af tilstande. Et billede af vores komplette gaskammeropsætning er vist i figur 2 . Vi har overvåget iltkonc…

Discussion

Her har vi præsenteret en nem, men robust ny metode til at fremkalde hypoxi, der er indstillet til brug med frø- og zebrafiskembryoner, men kan også være egnet til andre vandlevende organismer. Den største fordel ved denne metode ligger i dens enkelhed og omkostningseffektivitet. Ikke desto mindre er de opnåede resultater med denne metode meget robuste. Vi har vist, at hypoxi effektivt kan induceres i kammeret både i hele embryoner såvel som i specifikt væv – her er retina. For at bestemme effektiviteten af ​…

Materials

Sodium chloride	Sigma	S7653	NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride	Sigma	P9333	KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES	Sigma	H3375	0.1X MBS
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate	Sigma	202967	Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride	Sigma	C1016	CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue	Sigma	M9140	Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma	CG10	frog fertilization
Zebrafish breeding tank	Carolina	161937	gas chamber construction
24-well plate	Thermo Scientific	142475	Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin	RS Components UK	Kit 199-1468
Gas distributor valve	WPI Luer Valves	Kit 14011	aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve	BOC	200 bar HiQ C106X/2B	gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank	BOC	226686-L	hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser	CO2 Art	Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005	Schema 1, J
silicone grease	Scientific Laboratory Supplies	VAC1100	Schema 1, K
oxymeter	Oxford Optronix	Oxylite, CP/022/001	hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor	Oxford Optronix	HL_BF/OT/E	hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette	Sterilin	STS3855604D	for embryo transfer
MS222	Sigma Aldrich	E10521-50G	embryo anesthetic
RIPA buffer	Sigma	R0278-50ML	tissue homogenization
Protease inhibitor	Sigma	P8340	tissue homogenization
Tris	Sigma	77-86-1	4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol	Sigma	G5516	4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma	L3771	SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	4X Laemmli loading buffer
Trizma base	Sigma	77-86-1	5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine	Sigma	G8898	5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol	Sigma	34860	Transfer buffer
Tween 20	Sigma	P2287-500ML	10X TBST
skim milk powder	Sigma	70166	Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube	Sigma	T9661
tissue homogenizer	Pellet Pestle Motor Kontes	Z359971	tissue homogenization
pellet pestles	Sigma	Z359947-100EA	tissue homogenization
precast 12% gel	Biorad	Mini-ProteinTGX, 456-1043	Western Blot
protein ladder				Amersham	Full-Range Rainbow ladder, RPN800E	Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm)	Biorad	162-0115	Western Blot
anti-HIF-1α antibody	Abcam	ab2185	Western Blot
anti-α-tubulin antibody	Sigma	T6074	Western Blot
goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab6789	Western Blot
goat anti-mouse antibody	Abcam	ab97080	Western Blot
Pierce ECL 2 reagent	Thermo Scientific	80196	Western Blot
ECL films Hyperfilm	GE Healthcare Amersham	28906837	Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine	santa cruz	CAS 61135-33-9	EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline	Oxoid	BR0014G	1X PBS
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908	Fixation solution
Sucrose	Fluka	S/8600/60	Solution solution
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	PBST
Heat-inactivated Goat Serum	Sigma	G6767-100ml	HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306	DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide	Molecular Probes	C10338	DMSO, EdU incorporation
glass vial	VWR	98178853	EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound	Scigen	4563	embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E	Leica	CM3035S	EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass	Thermo Scientific	J1800AMNZ	EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit	Molecular Probes	C10338	EdU incorporation analysis
FluorSave	Calbiochem	D00170200	mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips	VWR	ECN631-1575	EdU incorporation analysis
fluorescent microscope	Nikon	Eclipse 80i	EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope	Olympus	Fluoview FV1000	EdU incorporation analysis
Volocity software	PerkinElmer	Volocity 6.3	EdU incorporation analysis