Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen
Summary
Wir stellen ein neuartiges hypoxisches Kammersystem für die Verwendung mit Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen vor. Unser System ist einfach, robust, kostengünstig und ermöglicht die Induktion und Aufrechterhaltung der Hypoxie in vivo und für bis zu 48 h. Wir präsentieren 2 reproduzierbare Methoden zur Überwachung der Wirksamkeit der Hypoxie.
Abstract
Hier stellen wir ein neuartiges System zur Hypoxie-Induktion vor, das wir entwickelt haben, um die Auswirkungen von Hypoxie in Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen zu untersuchen. Unser System besteht aus einer Kammer mit einem einfachen Aufbau, der dennoch robust ist, um eine spezifische Sauerstoffkonzentration und Temperatur in jeder experimentellen Lösung der Wahl zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Das dargestellte System ist sehr kostengünstig, aber hochfunktionell, ermöglicht die Induktion und Erhaltung von Hypoxie für direkte Experimente in vivo und für verschiedene Zeiträume bis zu 48 h.
Um die Wirkungen von Hypoxie zu überwachen und zu untersuchen, haben wir zwei Methoden angewendet – die Messung der Ebenen des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1alpha (HIF-1α) in ganzen Embryonen oder spezifischen Geweben und die Bestimmung der retinalen Stammzellproliferation durch 5-Ethinyl-2'- Desoxyuridin (EdU) Einarbeitung in die DNA. HIF-1α-Spiegel können als allgemeiner Hypoxie-Marker im ganzen Embryo oder Gewebe dienenDer Wahl, hier embryonale Netzhaut. EdU-Inkorporation in die proliferierenden Zellen der embryonalen Retina ist eine spezifische Ausgabe der Hypoxie-Induktion. So haben wir gezeigt, dass hypoxische embryonale Netzhautvorläufer die Proliferation innerhalb von 1 h der Inkubation unter 5% Sauerstoff sowohl von Frosch als auch von Zebrafischembryonen verringern.
Einmal gemeistert, kann unser Setup für die Verwendung mit kleinen aquatischen Modellorganismen, für direkte in vivo Experimente, jede gegebene Zeitspanne und unter normaler, hypoxischer oder hyperoxischer Sauerstoffkonzentration oder unter irgendeinem anderen Gasgemisch eingesetzt werden.
Introduction
Hypoxie-Forschung hat zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören die Untersuchung der Pathogenese und die Entwicklung von Behandlungen für medizinische Zustände, die durch Hypoxie 1 und akute Höhenkrankheit gekennzeichnet sind 2 . Hypoxischer Stress verursacht große metabolische Veränderungen in allen Organismen, die Sauerstoff benötigen. Hypoxischer Stress beeinflusst auch das fetale Wachstum und die Entwicklung und die Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten, einschließlich der intrauterinen Wachstumsbeschränkung 3 . Hypoxischer Stress kann nicht nur zu reduziertem Geburtsgewicht, fetaler und neonataler Mortalität führen, sondern kann auch zu vielen Komplikationen im Erwachsenenleben führen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Fettleibigkeit und Hypertonie 4 . Ein hypoxischer Stress wird auch häufig während der soliden Tumorentwicklung beobachtet, wenn das Tumorgewebe seine Blutversorgung erweitert. Es ist daher entscheidend, die Auswirkungen von Hypoxie in vivo und direkt während der Embr Yonische Entwicklung.
Unter den bekanntesten Methoden, die zur Untersuchung von Wirkungen von Hypoxie während der Entwicklung angewendet wurden, ist die Verwendung von Kobaltchlorid im Wachstumsmedium oder die Inkubation des Organismus in einer hypoxischen Kammer. Kobaltchlorid induziert aufgrund seiner Rolle bei der Stabilisierung von hypoxieinduzierbarem Faktor-1 alpha (HIF-1α) durch die Verhinderung seines proteosomalen Abbaus 5 , 6 , 7 künstlich eine hypoxische Reaktion unter normaler Sauerstoffkonzentration. Allerdings kann die Verwendung von Cobaltchlorid sowie anderer ähnlicher chemischer Hypoxie-Mimetika eine unspezifische schädliche Wirkung auf Zellen und Gewebe, z . B. Apoptose 9, aufweisen . Daher sind hypoxische Kammern eine bessere Methode zur Induktion von "natürlicher Hypoxie" in lebenden Organismen durch den Verlauf der normalen Entwicklung.
Wir haben uns auf die Entwicklung eines Systems zur Induktion von Hypoxie in Wassertierembryonen konzentriert. Beide Frösche und Zebrafisch sind mittlerweile zu informativen Wirbeltiermodellorganismen für Studien zahlreicher biologischer Prozesse sowie zu Modellen für verschiedene menschliche Krankheiten geworden. Frosch- und Zebrafisch-Embryonen Entwickeln sich nach außen, eliminieren die Komplikation der mütterlichen Kompensation, und ein schneller Entwicklungsverlauf ermöglicht es, Umweltfaktoren zu manipulieren und die phänotypischen Veränderungen der Organbildung in Echtzeit zu beobachten. Darüber hinaus sind viele Komponenten großer Signaltransduktionswege in hohem Maße konserviert Diese Modellorganismen sind im Detail durch eine große Anzahl von Literatur charakterisiert worden. Der Hauptvorteil bei der Verwendung von Fröschen und Zebrafisch-Embryonen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf die Wirbeltierentwicklung zu untersuchen, ist, dass alle Prozesse direkt überwacht werden können, da Sauerstoff schnell die Embryonen durchdringt. So, bei Fröschen und Zebrafisch, wie im Gegensatz zu anderen Modellorganismen wieMaus-Embryonen, kann der Einfluss einer spezifischen Sauerstoffkonzentration im interessierenden Gewebe untersucht werden, ohne die Anwesenheit oder den Mangel an funktionellem Gefäß zu berücksichtigen.Die meisten handelsüblichen Aufbauten für die hypoxische Inkubation haben den Nachteil, dass sie vergleichsweise groß sind und entsprechend hohe Betriebskosten aufweisen. Abgesehen von ihrem hohen anfänglichen Kosten- und Gasverbrauch erfordert die Äquilibrierung und die Aufrechterhaltung gemeinsamer Hypoxie-Kammern die Aufrechterhaltung einer konstanten hypoxischen Atmosphäre gegen den Gasgradienten, der in diesen Kammern aufgrund ihrer größeren und / oder organischen Atmung natürlich vorkommt. Dies erfordert die Verwendung von Gasventilatoren und ein Kühlsystem, das die Menge an zusätzlichen notwendigen Geräten erhöht, die Geschicklichkeit des Forschers beeinträchtigt und insgesamt die Einfachheit des experimentellen Verfahrens verringert. Im Gegensatz dazu ist das hier präsentierte Setup vergleichsweise robust, aber sehr kostengünstig, klein, einfach zu ermitteln und erlaubt fAst Gas-Äquilibrierung, stabile hypoxische Atmosphäre und einfacher Austausch von Materialien und Lösungen in der Kammer. Unser System kann für den Einsatz mit jedem aquatischen Modell Organismus von Interesse eingesetzt werden.
Wir haben eine hypoxische Kammer konstruiert, die bequem klein ist und daher in einem gemeinsamen Laborinkubator platziert werden kann, was leicht experimentelle Eingriffe bei einer bestimmten Temperatur ermöglicht. Durch die bequeme Kontrolle der Temperatur sowie der Sauerstoffkonzentration im Medium liegt der Vorteil unseres Systems gegenüber den handelsüblichen Hypoxieinkubatoren in seiner geringen Größe und Kosteneffizienz. So kann unser Setup mit Hilfe von Laboratorien für die meisten Laboratorien eingerichtet werden und erfordert keine teuren Materialien. Darüber hinaus erzeugt unser Setup keine Hitze, im Gegensatz zu den handelsüblichen Hypoxie-Inkubatoren und ermöglicht die Verwendung bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur in einem Inkubator. Das laSt ist besonders kritisch für die Arbeit mit kaltblütigen Organismen wie Frösche und Fische, wo Entwicklungs- und Stoffwechselraten stark temperaturabhängig sind.
Als sehr kostengünstig und leicht zu bauen ist unsere Gasinkubationskammer dennoch sehr vielseitig einsetzbar, um verschiedene hypoxische oder hyperoxische Zustände zu etablieren und eine schnelle und einfache Verabreichung unterschiedlicher Medien und Lösungen für eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht unser System die Verwendung einer 24-Well-Platte anstelle von üblicherweise verwendeten Speisen oder Labortanks 10 , 11 , 12. Unser System ermöglicht die Beobachtung und experimentelle Behandlung von mehreren Mutantenbedingungen auf einmal.
Um die korrekte Induktion der Hypoxie zu kontrollieren, haben wir die Niveaus des HIF-1α-Proteins durch Western-Blot-Detektion überwacht. Darüber hinaus ist die Anzahl der proliferierenden Zellen vor und nach der InkubationN in der hypoxischen Kammer kann verwendet werden, um festzustellen, ob Hypoxie im Gewebe induziert worden ist. Diese Methode basiert auf unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 13 , die zeigen, dass die Proliferation in der embryonalen retinalen Stammzellnische bei der Induktion der Hypoxie abnimmt. So haben wir das Niveau der Retinal-Stammzell-Proliferation durch Zugabe von 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) zum Embryonemedium überwacht und deren Einarbeitung in die DNA von neu proliferierenden Zellen gemessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine einfache, aber robuste neue Methode vorgestellt, um eine Hypoxie zu induzieren, die für den Einsatz mit Frosch- und Zebrafisch-Embryonen angepasst ist, aber auch für andere Wasserorganismen geeignet ist. Der wesentliche Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz. Dennoch sind die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sehr robust. Wir haben gezeigt, dass Hypoxie in der Kammer sowohl in ganzen Embryonen als auch in spezifischem Gewebe effizient induziert werden kann – hie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Unterstützung von Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z an WAH und dem DFG-Stipendium KH 376 / 1-1 an HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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