Summary
תאים עצביים עכבר מתורבת על מערכים אלקטרודה רב להציג עלייה בתגובה בעקבות גירוי חשמלי. פרוטוקול זה מדגים כיצד נוירונים תרבות, כיצד להקליט פעילות, וכיצד להקים פרוטוקול להכשיר את הרשתות להגיב על דפוסי גירוי.
Abstract
מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEA) יכולים לשמש לבדיקת רעילות לתרופות, פרדיגמות עיצוב עבור הרפואה המותאמת אישית של הדור הבא, וללמוד את הדינמיקה של הרשת בתרבויות עצביות. בניגוד לשיטות מסורתיות יותר, כגון תיקון clamping, אשר יכול רק להקליט פעילות מתא יחיד, MEAs יכולים להקליט בו זמנית מאתרים מרובים ברשת, ללא צורך במשימה מפרך של הצבת כל אלקטרודה בנפרד. יתר על כן, רבים תצורות שליטה גירוי ניתן ליישם בקלות בתוך ההתקנה ניסיוני אותו, ומאפשר מגוון רחב של דינמיקה להיחקר. אחד הדינמיקה המפתח של עניין אלה במבחנה מחקרים כבר עד כמה רשתות תרבותיות להציג מאפיינים המעידים על למידה. תאים עצביים עכבר מתורבת על MEAs להציג עלייה בתגובה לאחר האימון המושרה על ידי גירוי חשמלי. פרוטוקול זה ממחיש כיצד התרבות תאים עצביים על MEAs; בהצלחהכבל מ מעל 95% של מנות מצופה; להקים פרוטוקול להכשרת הרשתות להגיב לדפוסים של גירוי; ו למיין, מגרש, ולפרש את התוצאות של ניסויים כאלה. השימוש במערכת קניינית לגירוי והקלטת תרבויות עצביות מוכיח. חבילות תוכנה משמשות גם למיון יחידות עצביים. ממשק משתמש גרפי מעוצב בהתאמה אישית משמש לדמיין היסטוגרמות שלאחר הגירוי שלאחר, מרווחי inter-interst, משך התפרצות, כמו גם להשוות את התגובה הסלולרית לגירוי לפני ואחרי פרוטוקול האימון. לבסוף, נדונו תוצאות מייצגות וכיוונים עתידיים של מאמץ מחקרי זה.
Introduction
מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEA) יכולים לשמש לבדיקת רעילות סמים, פרדיגמות עיצוב לדור הבא של הרפואה המותאמת אישית, וללמוד דינמיקה רשתית בתרבויות עצביות 1 . בניגוד לשיטות מסורתיות יותר, כגון תיקון הידוק, אשר יכול רק להקליט פעילות מתא בודד, או הקלטה שדה עם פיפטה זכוכית, אשר יכול להקליט תגובות תאיים מן הנוירונים המקיפים את האלקטרודה באתר יחיד MEAs יכול בו זמנית להקליט מאתרים מרובים בתרבות תאים ללא צורך במשימה מפרך של הצבת כל אלקטרודה בנפרד. זה מאפשר את המחקר של אינטראקציות דינמיות בין קבוצות של תאים היוצרים רשת בתוך תרבות זו. יתר על כן, את ההשפעות של גירוי חשמלי על דפוסי ירי ברשת 2 , 3 , 4 , 5 ושליטה ברשת 6 </ Sup> בתרבויות העצביות תועדו היטב, ותצורות רבות של גירוי חשמלי ובקרות ניתן ליישם בקלות בתוך אותו ההתקנה ניסיוני, המאפשר מגוון רחב של דינמיקה ספקטור-טמפורלית להיחקר.
אחד הדינמיקה המרכזית של עניין אלה במבחנה מחקרים היה עד כמה רשתות תרבותיות להציג מאפיינים המעידים על למידה 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . מעבדה Peixoto בעבר בחן את ההשפעות של אותות אימון בתדר גבוה, כמתואר Ruaro et al. 14 , על רשתות של נוירונים העכבר מצופה על מערכים microelectrode 15 . בניסויים אלה, רשתות הראו עלייה בתגובה followinG האימון המושרה על ידי גירוי חשמלי. התגובה המוגברת נחשבה לצורה של למידה באמצעות הכרה בגירוי, לפיה הרשתות הגיבו באופן עקבי לשינוי הגירוי לאחר יישום פרוטוקול גירוי ספציפי ( כלומר, אימון).
פרוטוקול זה מדגים כיצד התרבות תאים עצביים על MEAs, להקליט בהצלחה מעל 95% של מנות מצופה, להקים פרוטוקול להכשיר את הרשתות להגיב על דפוסים של גירוי, מיון יחידה יחידה יחידה, היסטוגרמה העלילה, ולפרש את התוצאות מ ניסויים כאלה. השימוש במערכת קניינית (ראה טבלה של חומרים ) עבור גירוי והקלטת תרבויות עצביים מוכיח, כמו גם את היישום של חבילות תוכנה (ראה טבלה של חומרים ) כדי למיין יחידות עצביים. ממשק משתמש גרפי מעוצב בהתאמה אישית (ראה טבלה של חומרים ) משמש לדמיין post-sזמן היסטוגרמה זמן, מרווחי inter-interstals, משך פרץ, כמו גם להשוות את התגובה הסלולרית לגירוי לפני ואחרי פרוטוקול אימון.
Protocol
כל נוהלי בעלי החיים עומדים בהנחיות NIH ו / או במדיניות שירותי בריאות הציבור על טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה, והם נמצאים תחת פרוטוקול טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים (IACUC) מאוניברסיטת ג'ורג 'מייסון.
1. הכנה חומרית
- החיטוי החומרים הבאים: 5.75 אינץ 'ארוך פיפטות זכוכית מסודרים אנכית ב (2) 500 כוסות מ"ל, כ 24 חתיכות של נייר סינון (150 מ"מ קוטר, כל אחד לחתוך לתוך 8 טריזים, גודל הנקבוביות לא משנה), 1000 μL מסונן פיפטה טיפים, 200 μL סינון טיפים פיפטה, 10 μL סינון טיפים פיפטה, ו de-ionized (DI) מים עבור שוטף (לפחות 200 מ"ל).
- הכינו את ריאגנטים ומדיה.
- הכן את כל ריאגנטים התקשורת ב biohood באמצעות טכניקות aseptic.
- הכן Poly-D- ליזין (PDL) לפי טבלה 1 .
- מערבבים את PDL עם מים סטריליים DI לגמר געל הריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל, כדלקמן. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר 96 מ"ל של מים די סטרילי על בקבוק זכוכית מגיב autoclaved.
- השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להוסיף 4 מ"ל של מים סטריליים DI לבקבוקון היצרן המכיל PDL. ממיסים את PDL ידי pipetting. השתמש פיפטה אותו להעביר את הפתרון PDL בקבוק זכוכית מגיב המכיל את 96 מ"ל של מים די סטרילי.
- מכסה את הבקבוק היטב לפני הסרת אותו מן biohood ו מערבולת הפתרון. ב biohood, לחלק את הפתרון לתוך 5 מ"ל aliquots; להקפיא כל פתרון בשימוש ב -20 מעלות צלזיוס. PDL מופשר ניתן להקפיא מחדש פעם אחת. מחק פתרון מופשר אם מחדש קפוא לפני.
- הכן פתרון laminin לפי טבלה 2 .
- מערבבים את laminin עם PBS לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל, כדלקמן. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר 49 מ"ל של PBS לצינור 50 צנטריפוגות מ"ל.
- השתמש serologica סטריליתL פיפטה להוסיף 1 מ"ל של PBS לבקבוקון היצרן המכיל את המשקל המתאים של laminin. ממיסים את laminin ידי pipetting. השתמש פיפטה אותו להעביר את תמיסת laminin לצינור 50 מ"ל צנטריפוגות המכיל את 49 מ"ל של PBS.
- כובע את הצינור בחוזקה לפני הסרת אותו מן biohood ו מערבולת הפתרון. ב biohood, לחלק את הפתרון לתוך 5 aliquots מ"ל; להקפיא כל פתרון בשימוש ב -20 מעלות צלזיוס. Laminin מופשר לא ניתן להקפיא מחדש; להשליך כל פתרון מופשר בשימוש.
- הכן מדיום אחסון, בהתאם ללוח 3 .
הערה: אמצעי אחסון משמש לאחסון רקמות למשך עד חודש ברמות CO2 של הסביבה. זה ניתן לרכוש (ראה טבלה של חומרים), או שהוא יכול להיות מוכן באמצעות המתכון הכללי של: הסביבה CO 2 תא אחסון בינוני + 2% ללא תוספת בסרום לתרבות תאים עצביים + 0.5 מ"מ תרבות תאים התא המכיל התייצב צורה של L- גלוטמין (ראה טבלה של חומרים).- כדי להפוך 10 מ"ל של מדיום אחסון, להעביר 10 מ"ל של מדיום אחסון עבור רקמות עובריים ללא CaCl 2 לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הוסף 210 μL של תוסף חינם בסרום לתרבות תאים עצביים ו 55 μL של צורה מיוצב של L- גלוטמין. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- כמו המדיום אחסון קל רגיש, להגן עליו על ידי כיסוי צינורות 15-מ"ל צנטריפוגה עם רדיד אלומיניום. Aliquot 2 מ"ל של מדיום אחסון לכל צינור עבור סך של 5 aliquots. חנות במקרר עד 2 שבועות או עד מוכן לשימוש, אבל לא להקפיא.
- הכן DMEM 5/5 בינוני, לפי טבלה 4 .
- Aliquots ההפשרה של תוספת ללא תוסף חינם לתרבית תאים עצביים, בסרום הסרום (HS), בסרום שור עוברית (FBS), וחומצה אסקורבית. להפשיר aliquot של סטרפה, אם יש צורך, כדי לשלוט זיהום חיידקי. פיפטה כל מרכיב לתוך צינור 50 צנטריפוגה מ"ל. ודא כי טיפים פיפטה לא לגעת כל משטחים או objecTs.
- בתוך biohood, לחבר את המסנן אל צינור ואקום עם ואקום עדיין כבוי. יוצקים את התערובת לתוך המסנן הדף ולסגור אותו. הפעל את הוואקום של biohood ולתת את המסנן בינוני לתחתית המיכל. נתק את המסנן מהחלל לפני כיבוי הריק.
- הדק את המכסה על מיכל בינוני סטרילי, תווית אותו, ולאחסן כל בינוני בשימוש על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. פתח את המיכל בתוך biohood כדי לשמור על סטרילי בינוני.
- הכן DMEM + בינוני, לפי טבלה 5 .
- Aliquots להפשיר של תוסף ללא תוסף עבור תרבות תאים עצביים וחומצה אסקורבית (ו עט סטרפ, אם יש צורך). פיפטה כל מרכיב לתוך צינור 50 צנטריפוגה מ"ל. חזור על שלבים 1.2.5.2-1.2.5.3 עבור התהליך הנותר.
2. מערך מערך / הכנה
הערה: MEAs המשמשים בהליך הם מערכים 60 ערוצים oRganized ב 8 x 8 מרובע. המרחק interelectrode הוא 200 מיקרומטר, וכל אלקטרודה היא 10 מיקרומטר בקוטר. החומר המוליך את המסילה הוא טיטניום, ואת האלקטרודות עצמן עשויים TiN. טבעת זכוכית סביב האלקטרודות הוא 6 מ"מ גבוה, עם קוטר חיצוני 24 מ"מ. כובע עשוי polyoxymethylene (POM) משמש כדי לכסות את MEA, ו-חדיר גז / נוזלי בלתי חדיר אתילן פרופילן פרופילן (FEP) הסרט משמש כדי למנוע זיהום במהלך ההקלטה הפעלות גירוי.
- יום לפני ציפוי.
- הפוך MEAs hydrophilic שאינם בשימוש על ידי חשיפת אותם פלזמה; זה בדרך כלל לא הכרחי לאחר השימוש הראשון. ודא coverslips זכוכית המשמשים תרבויות שליטה גם לקבל טיפול פלזמה.
הערה: מנות פלסטיק פטרי (35 מ"מ) עשוי לשמש גם מנות שליטה לא צריך שום טיפול מראש.- ניהול הטיפול פלזמה באמצעות etcher פלזמה עבור 40-60 של חצי כוח (50 W), wiה לחץ קאמרי מוגדר 100-150 mT.
- מיד למלא את MEAs עם מים DI. לצלול את coverslips בצלחת פטרי מלא במים DI. השאירו את המים DI במגע עם משטחים מטופלים במשך כ 15 דקות.
- בתוך biohood, שאיבה את המים DI. ממלאים את MEAs את השפה עם אתנול 70%. הסר את המים DI מ צלחת פטרי המכיל את coverslips ולמלא את צלחת פטרי עם אתנול עד coverslips הם שקוע לחלוטין. אפשר זאת לשבת במשך 10-15 דקות.
- תווית כל צלחות פטרי מנות שליטה עם MEA ID #, תאריך ניתוח, סוג התא, ראשי התיבות. לאחר מכן, במקום כל MEA בצלחת פטרי שכותרתו.
- מניחים את MEAs לתוך מנות בודדות פטרי ולהסיר אתנול באמצעות שאיבה ואקום. מלאו את MEAs עם מים סטרילי DI כדי להסיר את כל אתנול שיורית. השתמש יניקה ואקום כדי להסיר את המים DI. תן MEAs אוויר יבש בתוך biohood.
- הוסף 40-70 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל פולי- D- ליזיןE (PDL, משקל מולקולרי גבוה, לפחות 50 kDa) למרכז של כל MEA ו 0.2 מ"ל שולטת באמצעות טיפים פיפטה סטרילית.
הערה: הקפד לא לגעת במרכז MEA עם פיפטה, קצה כמו זה עלול להזיק האלקטרודות. כמות המדויקת של PDL dispensed תלוי hydrophilicity של פני השטח. - מניחים פיסה קטנה של נייר רקמות מעבדה לתוך כל צלחת ולהרטיב אותו עם מים סטריליים, כדי למנוע אידוי PDL לילה. מכסים את כל הכלים לפני הסרתם מן biohood. מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הפוך MEAs hydrophilic שאינם בשימוש על ידי חשיפת אותם פלזמה; זה בדרך כלל לא הכרחי לאחר השימוש הראשון. ודא coverslips זכוכית המשמשים תרבויות שליטה גם לקבל טיפול פלזמה.
- יום ציפוי.
- ביום ציפוי, להפשיר 1 aliquot של laminin (20 מיקרוגרם / מ"ל); כל MEA דורש 40-50 μL של laminin, וכל צלחת שליטה דורש 0.2 מ"ל של laminin. חישוב נפח laminin הצורך מבוסס על מספר MEAs שולטת לשמש.
- מעבירים את כל הכלים מן האינקובטור כדי biohood.
- מלאו את כל MEAs עם סטרילימים DI באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית ולאפשר להם לשבת במשך 10 - 15 דקות. לשאוב את המים DI באמצעות טפיחות פסטר סטרילית לחזור על התהליך פעמיים.
- הוסף 40 - 50 μL של laminin מופשר למרכז של כל MEA ו 0.2 מ"ל של laminin כדי לוחות בקרה באמצעות טיפים פיפטה סטרילית. מכסים את כל MEAs מנות שליטה biohood ולהעביר אותם לחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
- בזהירות להסיר את laminin עודף ממרכז MEAs באמצעות שאיבה עם טפיחות פסטר סטרילית ולתת את פני השטח אוויר יבש לפני ציפוי.
- השאירו את הכלים biohood, או למקם אותם באינקובטור עד מוכן לצלחת התאים.
הערה: הכלים יכולים להישאר באינקובטור עד למחרת. עם זאת, אם יש צורך יותר זמן, רצוי לנקות את הכלים ולהתחיל מחדש מן השלב poly-D- ליזין (PDL) (שלב 2.1.6).
3. הסרת העובר ואת המוחהוֹצָאָה
- יוצקים L-15 (Leibovitz) בינוני לתוך 4 של 100 מ"מ צלחות פטרי. מכסים אותם ומניחים אותם במקפיא -20 מעלות צלזיוס עד בינוני יש עקביות slushy אבל לא קפוא מוצק (~ 40-60 דקות).
- האם זה כ 40 דקות עד 1 שעות לפני דיסקציה.
הערה: זה יהיה מגניב את העוברים ואת המוח במהירות, כך שיש להם עקביות המשרד לא להתפורר עם החילוץ. - הכן את אזור לנתיחה להסרת העובר.
- מניחים מגש עם קרח ליד הכיור לפרוס את כלי הניתוח וחומרים להסרת העובר. אלה כוללים 4 מנות פטרי עם קר L-15 "slush", מגבות נייר, בקבוק ספריי עם אתנול 70%, מלקחיים האצבע קהה האף , מלקחיים בסדר, מספריים כירורגי קטן, ומספריים גדולים ( איור 1 ).
- הכן את אזור לנתיחה למוח המוח.
- מניחים כוס צלחת פטרי faלמטה במגש מלא קרח.
- הניחו את כלי הניתוח וחומרים להפקת המוח, כולל מגבות נייר, מספריים כירורגיים קטנים, מרית דקה כפולה, בקבוק ריסוס מלא באתנול 70% ושקית ניילון לסילוק הפגר ( איור 2 ).
- ללבוש חלוק מעבדה, מסכת פנים וכפפות. ריסוס כל משטחי עבודה, כולל כפפות, עם אתנול 70%.
הערה: למרות שזה לא הליך סטרילי, עדיף להפחית את הסיכויים של זיהום ככל האפשר. - להרדים עכבר מתוזמן E17 בעקבות הנחיות NIH 16 ו / או שירותי בריאות הציבור על טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה תחת פרוטוקול טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים מאושר (IACUC) עבור CO 2 asphyxiation. הקפד לשחרר את גז CO 2 לאט לתוך החדר מעל 3 דקות עד 5 דקות תקופה כדי למנוע פאניקה או דיסקוMfort בעכבר.
- לערוף את העכבר ומניחים אותו על מגבת נייר, בצד הגחון למעלה. ריסוס הבטן התחתונה שלה עם אתנול 70%. בעזרת מספריים כירורגיים קטנים, לעשות לחתוך בצורת V דרך העור ושומן תת עורית של הבטן התחתונה, הארכת לחתוך את הקצוות הדיסטליים של חלל בית החזה וחושפים את הרחם.
- בעזרת מלקחיים, בזהירות להרים את הרחם בין העוברים. חותכים את רקמת החיבור עם מספריים לנתיחה עד הרחם כולו הוא בחינם. לשטוף בקצרה את הרחם עם אתנול 70% כדי להסיר כל דם ומניחים אותו באחד 4 צלחות פטרי מלא קר L-15.
- שחרר כל העובר מן הרחם ואת שק הפנים עובריים באמצעות זוג מלקחיים עדין. ודא כי כבל הטבור נותק ואת השק שליה הוסר. מניחים את העוברים משוחררים בצלחת השנייה מלא קר L-15. לערוף את העוברים עם מלקחיים ומספריים. בעזרת מלקחיים, להעביר את הראש לצלחת פטרי השלישי ואת הגופותעד רביעי, שניהם מלאים L15 קר.
4. הסרת קליפת המוח הקדמית
- בתוך biohood, במקום טריז של נייר מסנן autoclaved על צלחת זכוכית פטרי צלחת הבמה. מניחים ראש עוברים אחד על נייר הסינון. לאחוז את הגולגולת על ידי הצבת זוג מלקחיים דרך חללים העין עם היד הלא דומיננטי. הסר את העור ואת רקמת השריר הבסיסית עם זוג מספריים איריס.
- מניחים את חוד החנית של התחתונה התחתון של מספריים איריס לתוך הבסיס של הגולגולת. שמירה על התחתונה על פני השטח הפנימי של הגולגולת, הרחק מהמוח, לחתוך את הצלחת החציונית ולאחר מכן לאורך קו האמצע בין צלחות הקודקוד. המשך חיתוך rostrally, בין צלחות הגולגולת חזיתית סחוס.
- החל ממרכז הצלחת החיצונית, לעשות חתך מאונך מצד שמאל ועל ימין של לחתוך את המרכז.
- הסר את המוח על ידי הזזה בזהירות מרית קטנה בין פני הגחוןשל המוח ואת צלחות הגולגולת התחתונה עד שהוא לגמרי מתחת למוח. הרם את המרית למעלה; כל המוח יצא שלם.
- מניחים כמה טיפות של L-15 בינוני על נייר הסינון, כך המוח אינו מקל על הנייר בעדינות להחליק את המוח מן המרית על נייר הסינון, בצד הגחון למטה. בזהירות לחתוך את הנורה חוש הריח עם קצה המרית.
- בעזרת מרית נקייה, לנתח את האונה הקדמית בתבנית טרפז. מעבירים את הרקמה צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל בינוני אחסון. חזור על האמור לעיל עם עוברי הנותרים. הקפד להשתמש טריז טרי של נייר סינון בכל פעם ( כלומר, טריז אחד של נייר סינון בראש).
5. דיסוציאציה תאית
- ב biohood, להרכיב את הפריטים המפורטים בטבלה 6 .
- השתמש פיפטה סטרלית סטרילית להוסיף 5 מ"ל של DMEM + בקבוקון של papain; חימם DMEM + ניתן להשתמש כדי לפזר את papain. בעדינותפיפטה לערבב את הפתרון.
- השתמש micropipette סטרילית להוסיף 0.5 מ"ל של DMEM + בקבוקון של DNase. הימנע pipetting חזקים בעת ביצוע פתרון DNase, כי DNase הוא רגיש denaturation גזירה.
- העברת 2.5 מ"ל של פתרון papain לצינור צנטריפוגות סטרילית ולהוסיף 125 μL של DNase לאותה צינור. מערבבים את הפתרון על ידי הפיכת בעדינות צינור צנטריפוגה הכתף על 8 פעמים.
- באמצעות פיפטה סטרילית, רחב נשא, להסיר את הרקמה מהצינור המכיל אמצעי אחסון ומניחים אותו לתוך צלחת פטרי סטרילי, 35 מ"מ. לאסוף מדיום קטן ככל האפשר. השתמש פיפטה סטרילית להסיר ככל אמצעי אחסון עודף ככל האפשר מבלי להסיר את הרקמה. הרקמה לא צריך להיות צף בינוני, אבל זה צריך להיות לח.
- השתמש שני להבים אזמל סטרילי כדי לכרות את הרקמה. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להוסיף 2.5 מ"ל של תערובת DNase / papain לרקמה טחון בצלחת פטרי. בעדינות מערבולת צלחת פטרי כדי להבטיח לאכובע רקמה כל ללא פתרון ולא דבק לתחתית המנה. מניחים את המנה בחממה 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- ב biohood, להשתמש פיפטה העברת סטרילית, רחב נשא להעביר את כל התקשורת ורקמות צינור סטרילי, 5 מ"ל cryogenic. מניחים את קצה זהה פיפטה העברת נשא רחב קרוב לתחתית של הצינור. בעדינות triturate ידי pipetting לאט למעלה ולמטה 10-15 פעמים.
- הימנע יצירת בועות בעת pipetting. חזור על התהליך באמצעות פיפטה העברת קטן נשא עד תערובת הומוגנית מושגת. אם הרקמה אינה מנותקת, triturate באמצעות פיפטה 1000 μL.
- הוסף 2 מ"ל של DMEM מחומם 5/5 לתערובת התא ניתק. שווי צינור צנטריפוגה בזמן שהוא עדיין biohood. לערבב בעדינות על ידי היפוך. צנטריפוגה ב כ 573 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס).
- ב biohood, להשתמש פיפטה סטרלית סטרילית להסיר ולהשליך את כל supernatant, מבלי לשבור אתגְלוּלָה. השתמש פיפטה סטרילית להוסיף 1 מ"ל של DMEM מחומם 5/5 ל גלולה בצינור כדי להשעות מחדש את התאים. השתמש פיפטה העברת סטרילי, קטן נשא נשא לשבור את גלולה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עד תערובת הומוגנית.
הערה: הימנע יצירת בועות בעת pipetting. אם רקמות מעט מאוד נאסף, להוסיף רק 0.5 מ"ל של DMEM 5/5. - בתוך biohood, להשתמש פיפטה סטרילית להעביר 10 μL ההשעיה התא לצינור microcentrifuge. מחוץ biohood, להוסיף 10 μL של Trypan כחול μL 10 ההשעיה התא בצינור microcentrifuge.
הערה: שלב זה אינו מחייב סטריליות. - טען 10 μL של ההשעיה תא טריפן כחול לתוך שבב hemocytometer חד פעמי על מנת לספור את התאים.
6. ציפוי תאים
- ב biohood, להשתמש micropipette סטרילית להעביר 50 μL ההשעיה התא למרכז כל מערך וכל צלחת פטרי שליטה. השתמש אחד piפטה עצה לכל מנה. הקפד לשים את התאים בדיוק במרכז המערך. הרטיבו מחדש את נייר הרקמה במעבדה שהיה בצלחת עם מים סטריליים, או הניחו נייר נייר חדש לכל מנה. מכסים את הכלים.
- מניחים את מנות פטרי מכוסה להגדיר אינקובטור ל 37 מעלות צלזיוס ו 10% CO 2 עבור 3-4 שעות.
- ב biohood, בעדינות להוסיף 1 מ"ל של חימם DMEM 5/5 לכל MEA.
הערה: הימנע לשטוף את התאים מן המערך במרכז בעת הוספת המדיום (חשוב!). בזהירות רבה, להשתמש micropipette סטרילית להוסיף טיפה אחת בכל פעם סביב הקצוות הפנימיים. - מניחים כובע המכיל קרום FEP חדיר גז על כל MEA. להחזיר אותם לאינקובטור במשך יומיים.
הערה: המכסה מונע זיהום ואידוי. עקוב אחר טכניקה aseptic, ייבוש הכובעים biohood עם אתנול 100% לפני לשים אותם על MEA. התרבויות חייב להיות capped בתוך biohood ואת חייבת להישאר capped בכל עת.
7. ראשילהשקות את התרבויות
- לאחר יומיים, לבצע החלפת בינוני מלא עם DMEM חימם +.
- מעבירים רק כמה מנות מן האינקובטור כדי biohood בכל פעם כדי למנוע להדגיש את התרבויות זמן רב מדי.
- השתמש micropipette סטרילית 1 מ"ל לצייר את כל המדיום מן המנה על ידי הנחת בזהירות את קצה פיפטה על הקיר הפנימי של המנה, הימנעות לגעת בתאים במרכז. השתמש רק קצה פיפטה אחת לכל צלחת, כדי למנוע הפצת זיהום.
- השתמש micropipette סטרילית לוותר 1 מ"ל של DMEM + חם, בזהירות הצבת קצה פיפטה על הקיר הפנימי של המנה.
- בצע 50% שינויים בינוניים עם חימם DMEM +, כמתואר לעיל, 2-3 פעמים בשבוע עם לא יותר מ 4 ימים בין האכלות.
- השתמש micropipette סטרילי 1 מ"ל לצייר 500 μL של המדיום מן המנה. השתמש micropipette סטרילית לוותר 500 μL של DMEM + חם/ Li>
8. בדיקה ויזואלית חזותית
- בדוק את הדגימות צלחת כל יום אחר תחת מיקרוסקופ כדי לחפש כיסוי תא מעל המערך (באמצעות הגדלה 4X ו 10X) וזיהום (באמצעות הגדלה 20X), או חיידקי או פטרייתי.
הערה: איור 3a מציג דוגמה של כיסוי תא אופטימלי, ואילו איור 3b מראה תרבות עם צפיפות התא המסכן. - שבועיים לאחר ציפוי, לבדוק מדגם של מנות MEA לפעילות ספונטנית. שיא מ MEAs, כמתואר להלן, במשך 3-5 דקות. קוצים יתגלו אם הפעילות קיימת ( איור 4 ).
הערה: על הניסוי לקבוע מתי להתחיל בבדיקה על סמך סוג הניסוי וההשערה הנחקרים.- כדי להקליט פעילות ב- MEA, השתמש בציוד הבא: ספק כוח, מגבר, headstage / preamplifier, בקר טמפרטורה, גנרטור גירוי (ראה טבלה של חומרים איור 5 ).
- לפני הוצאת התרבויות מהאינקובטור, חבר את בקר הטמפרטורה והפעל את המערכת על ידי הפעלת אספקת החשמל (בהתאם להוראות היצרן), מה שמאפשר לצלחת הבסיס המחוממת של מגבר הקדם להגיע ל -35 מעלות צלסיוס.
- מניחים את התרבות כתרים ב preamplifier כך הקו השחור של MEA היטב מיישר עם הקרקע התייחסות. ודא כי סיכות preamplifier בשורה, כי החלק העליון של premplifier מאובטח, וכי מכסה התרבות עדיין על.
- לאחר התרבות ממוקם בצלחת, בטל את האפשרות "שינוי MEA" על תוכנת רכישת נתונים (עיין בטבלה של חומרים עבור שמות תוכנה ומדריכים למשתמש). בנוסף, בטל את סימון התיבה "Blanking" לפני ביצוע הקלטות.
- בחר "הורד" ב "MEA_Select" אחרי tהוא הציב את התרבות במערכת. ודא שהתוכנית מציגה את "הורד אישור" לפני שתמשיך.
- לחץ על "התחל" בסביבת התוכנה כדי להתחיל להמחיש את האותות. בחלון הראשי, בחר: "Spikes" → "Detection" → "Automatic", שנה את הערך "Std Dev" ל - "5" ולחץ על "רענן" כדי לאפס את הסף.
הערה: חלון "דוקרנים" מראה קוצים שעברו סף. - בחלון הראשי, בחר "מקליט" → "מקליט" → "עיון". שנה את הנתיב ואת שם הקובץ כדי לזהות את התאריך, השעה, הצלחת והניסוי. הגדר את מגבלת הזמן ( למשל, עד 5 דקות). לחץ על "עצור", "הקלט" ו- "הפעל". שים לב שההקלטה נעצרת באופן אוטומטי.
- פתח את תוכנת הגירוי. בחר "מקליט" → "מקליט" → "עיון" כדי ליצור קובץ ולהגדיר את הזמןלהגביל. לחץ על "עצור", "הקלט" ו- "Play" כדי להקליט שוב. לחץ על "הורד והתחל" (על תוכנת גירוי) עבור גירוי להיות מועברת לתבשיל.
- בחר בלחצן "שינוי MEA" שבבקרת התוכנה כדי לשנות את הכלים.
הערה: אין לשמור על התרבות מתוך חממה במשך יותר מ -30 דקות בכל פעם, ללא מערכת כדי לשמור על אווירה CO 2 סביב התרבות. אם נדרשות הפעלות הקלטה ארוכות יותר, השתמש במתאם זמין מסחרית כדי לספק CO 2 .
9. רשתות הדרכה
הערה: איור 6 מציג סקירה כללית של השלבים 9.1-9.3, המתוארים להלן.
- הקלט 5 דקות בסיס של פעילות ספונטנית מתרבות התא (כמתואר בשלב 8). לאחר הבסיס כבר הוקמה, לנהל 5 דקות לפני אימון גירוי חיטוט המורכב של 0.5 הרץ biphasicדופק עם משך הדופק 200 μs ו משרעת הדופק 900-mV ( איור 7 א ) באמצעות אלקטרודות גירוי שנבחרו, כפי שמוצג באיור 8 (עיין במדריך התוכנה בטבלה של חומרים לפרטים על איך לבחור את האלקטרודות גירוי).
- עם השלמת גירוי טרום אימון, לנהל "אימון" פרוטוקול לרשתות באמצעות אותן אלקטרודות כמו גירוי בדיקה. לספק את התדירות גבוהה רכבות פעם 2 כל, כפי שתואר Hamilton et al. 15 ( איור 7 ב ו איור 7 ג ).
הערה: אות ההדרכה מורכב מ -40 רכבות דופק. כל דופק הרכבת מורכבת של 100 פעימות biphasic, עם 4 אלפיות בין הפולסים, משך הדופק 200 μs, משרעת דופק 900 mV. - לאחר סיום תקופת האימון, לנהל 5 דקות לאחר אימון גירוי לתאים,זהה לגירוי טרום אימון. לאחר גירוי שלאחר האימון מסתיים, להקליט 5 דקות של פעילות ספונטנית שלאחר גירוי מן הרשת (כמתואר בשלב 8).
- השתמש בקבוצת בקרה נפרדת של MEAs כדי להסביר שינויים אפשריים בתגובת הרשת עקב תנודות טבעיות או אי-סטציונריות של המערכת. ניהול פרוטוקול הניסוי אותו תיאר לעיל לקבוצות ביקורת אלה, למעט העובדה שקבוצות הביקורת מקבלות תקופת אימוני השתמטות, שבה לא מנוהל כל אות אימון בפועל.
ניתוח נתונים
הערה: קבצי הנתונים נשמרים ומאוחר יותר ממוינים ליחידות עצביות באמצעות תוכנת מיון קניינית (ראה טבלת החומרים). ממשק משתמש גרפי מותאם אישית (GUI) משמש לטעון את היחידות ולנתח דפוסי פעילות בתרבויות, מרווחי inter-interstals, משך התפרצות, והיסטוגרמה בזמן הגירוי (PSTH) (ראה טבלת החומרים). PSTH הואהגרף החשוב ביותר שיש לנתח, כפי שהוא מציג את הפעילות של הרשת בגדלים bin (באורך משתנה), ובכך לספק ייצוג חזותי של התגובה של הרשת לגירוי המוצג.
- המרת קבצי נתונים .mcd לפורמט .plx באמצעות תוכנת מיון קנייני (עיין בטבלה של חומרים עבור שמות תוכנה ומדריכים למשתמש). יצא את קובץ ה- .px לקובץ .plx חדש בתוך אותה תוכנית. מיין את הערוצים ליחידות העצבית ( איור 9 ). לאחר השלמת המיון, ייצא את הנתונים כקובץ nex.
- פתח את קובץ ה- nex בתוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים ) ושמור אותו כקובץ .mat שיש לנתח באמצעות GUI מותאם אישית, הזמין באופן חופשי (ראה טבלת חומרים ).
הערה: ממשק המשתמש הגרפי (ראה טבלה של חומרים) מגרשים PSTHs על פי קלט המשתמש ( כלומר PSTH האוכלוסייה, PSTH הממוצע מוטה, או ערוץ בודדים PSTH), המאפשר סקירה כללית של הניסוי גירוי השוואה מיידית בין שלאחר ו מראש תמריצים קבצים. זה גם מגרשים את PSTHs הראשונית לעומת הסופי, אשר משווה את תגובת הרשת הראשונה 6 ו 6 האחרונות גירויים. ה- GUI מבצע מספר פונקציות נוספות, כגון קצב ספייק, מרווח בין-ספייק, קוצים לכל פרץ, מרווח בין-פרצופי ומשך פרץ, הן עבור קובצי גירוי והן קבצים עם פעילות ספונטנית. - ראשית, בחר קובץ .mat עם משתנים המכילים רכבות ספייק ומשתנה אחד המכיל את חפץ הגירוי; התסריט ינתח את הנתונים, ואת GUI הראשי יצוץ עם גרף ממוצע PSTH בצד ימין ( איור 10 ).
- לחץ על הכפתורים אלקטרודה פעיל לראות את הפרט PSTH (בכחול) בהשוואה PSTH הממוצע (באדום).
הערה: האלקטרודות הפעילות תהיה צבעונית להצגת מפת חום, כאשר ערכים גבוהים יותר (אדומים יותר) מייצגים יותרשיא ערכי PSTH, המציין תגובה חזקה יותר לגירוי. - בחר אפשרות ניתוח באמצעות התפריט המוקפץ. בחר את "הממוצע מוטה" כפתור לבחור קבוצה של אלקטרודות העלילה הממוצע של המשנה הזו; זה שימושי להשוואת התנהגות תת הרשת בתוך תרבות.
הערה: ישנן אפשרויות ניתוח שונות שנבחרו באמצעות התפריט המוקפץ, והן מוסברות כולן בלחצן "עזרה" בתוכנה. - בחר את "שמור תרשים" כפתור לשמור את הגרף המוצג כעת כקובץ jpeg ברזולוציה גבוהה. בחר בלחצן "טבלת נתונים" כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
- לחץ על הכפתורים אלקטרודה פעיל לראות את הפרט PSTH (בכחול) בהשוואה PSTH הממוצע (באדום).
Representative Results
באמצעות הנוהל המוצג כאן ( איור 11 ) , 60 ערוצים MEAs מצופה עם תאים נוירונים עכבר E17 הודגרו עד התרבויות כיסה את המערכים בשטיח בריא של תאים ( איור 12 איור 3 א ) . לאחר 3 שבועות של הדגירה ב 10% CO 2 ו 37 ° C, תרבויות נבדקו לפעילות ספונטנית באמצעות מערכת הקלטה מסחריים (ראה טבלה חומרים ). הטמפרטורה נשמרה ב 37 ° C במהלך ההקלטה באמצעות בקר טמפרטורה, שכן הטמפרטורה משפיעה על הפעילות העצבית ושיעורי הירי.
בדיקת פעילות
רשתות פעילות באופן ספונטני בדרך כלל מציגות דפוסי אות משתנים. תרבות פעילה ממוצעת יכולה לרשום פעילות ב40% מהאלקטרודות. אלה אתרי אלקטרודה פעיל, כמעט חצי לרשום אותות ספונטניים, עם ירי שיעורי החל 5-10 הרץ. חלקה רסטר מייצג של פעילות ספונטנית מוצג באיור 4 א . סימני הסימון מציינים את חותמות הזמן של פוטנציאל הפעולה שנרשם מ -9 אלקטרודות פעילות במהלך 20 שניות בחלון, בקצב רכישה של 25 קילו-הרץ וטווח מסנן bandpass בין 300 הרץ ו -3 קילו-הרץ. איור 4b מראה את הרעש הבסיסי ואת האות המסנן הגולמי המסונן במהלך 8 התפרצויות של פעילות לפני הליך המיון. כדי להפריד בין פוטנציאל הפעולה לרעש, ספים עבור כל ערוץ מוגדרים פי 5 את סטיית התקן של רעש הבסיס ומחושבים על פני 500 ms חלון 15 .
לפני הניתוח, הקוצים שהוקלטו עבור כל אלקטרודה סווגו באופן לא מקוון כדי להבחין בין physioפעילות לוגית וגורמים לגירוי באמצעות אלגוריתם k פירושו ניתוח רכיב עיקרי. אותות שזוהו כתגובות פיזיולוגיות נקבצו יחד כדי ליצור תגובה של האוכלוסייה בכל אלקטרודה ( איור 13 ודיאגרמה 9 ) .
אימון רשתות עצביות עם גירוי חשמלי
רשתות הוכשרו באמצעות גירוי חשמלי להחיל את התרבות ישירות באמצעות האלקטרודות MEA באמצעות גנרטור גירוי (ראה טבלה של חומרים). בקבוצה זו של תוצאות נציג, תצורה "L" בצורת 13 המורכבת שימש ( איור 8 ), אם כי תצורות רבות אחרות ניתן ליישם. מחקר הגילוי וההדרכה התבסס על פרמטרים שהוגדרו ב- Ruaro et al. 14
הבסיס נקבע תחילה על ידי הקלטה של 5 דקות של פעילות ספונטנית לפני גירוי. לאחר קו הבסיס הוקמה, 5 דקות לפני אימון גירוי חיטוט המורכב דופק 0.5 הרץ biphasic עם משך הדופק 200 μs ו משרעת הדופק 900 mV ( איור 7 א ) ניתנה באמצעות אתרי גירוי שנבחרו ( כלומר, "L" -מְעוּצָב). פרוטוקול אימון הועבר אז לרשתות כל 2 s באמצעות אותה קבוצה של אלקטרודות. אות ההדרכה היה מורכב מ -40 רכבות דופק, שכל אחת מהן מכילה 100 פעימות דו-קוטביות, עם תקופה של 4 מילי-שניות לדופק, משך דופק של 200 μs, ומשרעת דופק של 900 מילי-וולט ( איור 7 ב ' ואיור 7 ג' ). תקופת האימונים הזו באה לאחר מכן 5 דקות לאחר אימון שלב, בדומה לגירוי טרום אימון. הפרוטוקול היה אזסיכם עם הקלטה של 5 דקות של פעילות ספונטנית לאחר גירוי.
אותו פרוטוקול ניסיוני הוחל על קבוצת ביקורת של תרבויות כדי להסביר תנודות טבעיות בתגובת הרשת. ההבדל היחיד בפרוטוקול הבקרה, עם זאת, היה יישום של תקופת אימון דמה, שבמהלכה לא אותות אימון בפועל היה מנוהל.
ניתוחים סטטיסטיים של מערכי הנתונים ( כלומר, אימון לעומת שליטה) בוצעו עם ANOVA חד-כיווני, כאשר המשתנה "הכשרה" הוא גורם בין-נושא. חביון שימש גורם בתוך הנושא. אם נמצאה אינטראקציה משמעותית, בוצע הליך פוסט-הוק של טוקי. התוצאות הראו תגובה טרום אימון בתוך 20 מייל MS-stimulus, אם כי טווח הפעילות היה עקבי לאחר התגובה הראשונה. עם זאת, הפעילות שלאחר האימון לא רק הציגה Esponse בתוך 20 ms שלאחר הגירוי הראשון, כפי שניתן לראות במהלך אימון מראש, אבל זה גם הפגין פעילות משמעותית 30-50 MS שלאחר גירוי ( איור 14 ו איור 15 ) 15 . היה גם מתאם מובהק סטטיסטית של "תדר ספייק" לעומת "זמן לאחר גירוי" של "אמינות ספייק" לעומת "זמן לאחר גירוי". "מהימנות ספייק" יכולה להיות מוגדרת כהסתברות לראות תגובת רשת לגירוי, שבו תגובה לכל גירוי מוקצה ערך מקסימלי של 1. איור 16 מראה כמעט עלייה של 50% בתדר ספייק, כמו גם 30 עלייה של 50% באמינות ספייק עבור רשתות מאומנים לעומת שליטה בטווח של 20-50 MS שלאחר הגירוי. תוצאות אלו מראות כי האימון שינה באופן יסודי את הדינמיקה של הרשת.
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
איור 1 : כלים וחומרים המשמשים להסרת עובריים. ( א ) מגש מלא קרח. ( ב ) צלחות פטרי מלא קר L-15 "slush". ( ג ) מגבת נייר. ( ד ) בקבוק ריסוס עם אתנול 70%. ( E ) מלקחיים בסדר (x2). ( F ) מספריים כירורגיות קטנות. ( G ) מלקחיים אצבע קהה. ( ח ) מספריים גדולים. ( I ) תיק גוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : כלים וחומרים המשמשים להפקת המוח. ( א ב ) צלחת פטרי המכיל ראשי עוברים. ( C ) צנטריפוגות מכוסה צינור עם המדיום אחסון. ( D ) צלחת פטרי זכוכית הפוכה. ( ה ) נייר סינון אוטוקלאד. ( F ) כוס עם אתנול 70%. ( G ) פיפטה פלסטיק. ( ח ) מספריים איריס. ( I ) מלקחיים בסדר. ( י ) מרית כפולה דקיקה. ( K ) מגבת נייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : תרבויות אופטימליות לעומת לא אופטימליות. ( א ) מראה שטיח בריא של תאים המכסים את מערכים, בניגוד ( B ),שבו יש התפשטות תאים עניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : תוצאות נציג של פעילות ספונטנית. ( א ) נציג סריקה העלילה של פעילות ספונטנית. סימני הסימון מצביעים על פוטנציאל פעולה שנרשם מ -9 אלקטרודות פעילות במהלך 20 שניות בחלון, בקצב רכישה של 25 קילו-הרץ וטווח מסנן bandpass בין 3 קילו-הרץ ל -300 הרץ. ( ב ) נציג סינון פוטנציאל פעולה תאיים מאתר פעיל. איור שונה מהתייחסות 15 . אנא לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותרN של נתון זה.
איור 5 : הגדרת הקלטה. ( א ) גנרטור גירוי. ( ב ) בקר טמפרטורה. ( ג ) אספקת חשמל. ( D ) מגבר. ( E ) headstage / preamplifier. ( F ) Capped MEA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 : ייצוג סכמטי של פרוטוקול ההכשרה החשמלית. שיא בסיסית הראשונית במשך 5 דקות ו גירוי בדיקה במשך 3 דקות. החל גירוי tetanic על 90 s, אשר לא נרשם. החל להקליט גירוי בדיקה השני במשך 3 דקות בסיס סופי במשך 5 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7 : גירוי גדילה והדרכה פרמטרים של אותות. ( A ) גירוי מבוקר מורכב ± 900 mV bi-phasic פעימות מנוהל בתדירות של 0.5 הרץ. ( B ) הרכבות הדופק מורכב של 100, ± 900 mV דו פולסים פעימות בתדירות של 250 הרץ. ( C ) האות אימון מורכב של 40 רכבות הדופק מנוהל כל 2 s. איור שונה מהתייחסות 15 ."_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8 : ייצוג תצורת "L" - צורה. ריבועים מייצגים אלקטרודות בודדות מתוך MEA. ריבועים כחולים מצביעים על אלקטרודות המשמשות לגירוי, בעוד שכל האחרים משמשים להקלטות. איור שונה מהתייחסות 15 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9 : הבחנה בין יחידות רעש וגירוי חפצים. כמה לוחות עליונים ( A -
איור 10 : היסטוגרמה לאחר הגירוי (PSTH). ממשק משתמש גרפי (ראה טבלה חומרים ) מגרשים PSTHs על פי קלט המשתמש ( כלומר, PSTH האוכלוסייה, PSTH הממוצע מוטה, או הפרטערוץ PSTH), המאפשר סקירה כללית של הניסוי גירוי להשוואה מיידית בין שלאחר ו מראש תמריצים קבצים. זה גם מגרשים את PSTHs הראשונית לעומת הסופי; זה משווה את תגובת הרשת הראשונה 6 ו 6 האחרונות גירויים. ה- GUI מבצע מספר פונקציות נוספות, כגון קצב ספייק, מרווח בין-ספייק, קוצים לכל פרץ, מרווח בין-פרצופי ומשך פרץ, הן עבור קובצי גירוי והן קבצים עם פעילות ספונטנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 11 : סקירה כללית של הכנת תאים וציפוים. ( א ) עכבר E17 בהריון הוא מורדמים עם CO 2 . ( ב ) העכבר הוא עריפת ראשאד והרחם מוסר. ( ג ) העוברים משוחררים וערוף. ( ד ) המוח מופק מכל העובר ואת האונות המצחיות מוסרים. ( ה ) התאים מנותקים. ( F ) תאים ניתק מושעים בינוני. ( G ) תאים מושעה הם מצופה על 60 ערוצים רב מערכים אלקטרודה (MEAs). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 12 : תרבויות נוירונים מצופה על מערכים microelectrode. עכברי העכבר נוירונים הם מצופה על MEAs 60 ערוצים, המאפשרים הקלטה בו זמנית של הפעילות העצבית ברחבי הרשת מכל אלקטרודה. (איור שונהמתוך התייחסות 15 ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 13 : מיון התוכנית המשמש למיון גלי הגלילה מכל ערוץ. תוכנית המיון (ראה טבלת חומרים ) טוענת קובץ נתונים ומציגה את כל היחידות שנרכשו לראשונה עבור כל ערוץ. אחת משיטות אחדות נבחרה להקצות אותות ליחידות מסוימות. בדוגמה זו נבחרה אלגוריתם הקבץ k, והיחידה הצהובה (שכותרתה "יחידה a" בחלון התחתון) זוהתה. תוכנית אחרת (ראה טבלת חומרים ) משמשת לאחר מכן לייצוא קובץ. Nex לקובץ .mat, שהוא קובץ הקלט עבור GUI בהתאמה אישית (ראה
איור 14 : שינוי בפעילות הרשת בתגובה לגירוי לאחר תקופת ההדרכה. נציג סריקה העלילה של פעילות מתוך שמונה אלקטרודות. הקו האדום אנכי מציין את זמן הגירוי, ואת סימני תווית שחור מצביעים על פוטנציאל פעולה. ב הכשרה מראש ( א ), יש תגובה מיידית לדופק גירוי על פני ערוצים. לאחר אימון ( ב ), הרשת מציגה תגובה פעילות ממושכת יותר, כמו גם תגובה מיידית לגירוי 15 ..jpg.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 15 : רשתות מאומן יש תדרים ספייק משופעים משמעותית. התדירות של הרשת spiking עבור רשתות בקרה מחושב על ידי שילוב מספר קוצים מעל 50 ms מיד לאחר כל גירוי וחלוקת באותה תקופה. המוצג הוא הממוצע של 12 מאומנים ו -10 רשתות שליטה (את השגיאה ברים מצביעים על טעות תקן של הממוצע). הכוכבית (*) מציינת הבדל סטטיסטי ( p = value <0.05) בין שני מערכי הנתונים. איור שונה מהתייחסות 15 . אנא לחץ כאן כדי לראות larגרסת גיר של דמות זו.
איור 16 : תשובות מתווכות סינפטיות משתנות באופן משמעותי ברשתות מאומן. ( א ) אמינות ספייק, נמדד 10 ms מסגרות מנורמל לרשתות בקרה, מראה שום שינוי ההפעלה הישירה של נוירונים ליד אלקטרודות (0-20 MS). לכן אין הבדל סטטיסטי בין בקרות לרשתות מאומנות עבור אותם פחי. מאידך גיסא, תגובות החביון הארוכות יותר (30-50 אלפיות שנייה), מתואמות באופן סינפטי, דבר המעיד על כך ששיטה זו מספקת חקירה מפורטת יותר של אמינות מאשר בתרשים 15 לעיל. ( ב ) תדירות ספייק האוכלוסייה חוזר על התנהגות האמינות ולא מראה שום שינוי עבור ההפעלה הישירה (0-20 ms), בעוד statהבדל משמעותי מובהק נמצא לתגובות לטווח ארוך (30-50 ms). התנהגות זו עולה בקנה אחד עם התוצאות הממוצעות בתרשים הקודם. ברים שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של הממוצע, מחושב עבור 10 רשתות בקרה 12 רשתות מאומן. (*) P-value <0.05; (**) p-value <0.001. איור שונה מהתייחסות 15 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| כמות | פריט |
| 1 | זכוכית מגובבים זכוכית מגובבים (לפחות 100 מ"ל גודל) |
| 20 | 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 1 | 10 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 4 | 25 מ"ל סטריליפיפטה סרולוגית |
| 2 | 50 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 1 | צנטריפוגה צינור מדף |
| 150 מ"ל | מים סטריליים די |
| 5 מ"ג | פולי-D- ליזין בקבוקון |
טבלה 1: הכנת PDL - רשימה של חומרים ריאגנטים.
| כמות | פריט |
| 1 | 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 10 | 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 2 | 1 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית |
| 2 | 50 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 1 | צנטריפוגה צינור מדף |
| 1 מ"ל | פוֹספָט מאגר חיץ (PBS) |
| 1 מ"ג | Laminin |
טבלה 2: הכנת Laminin - רשימת חומרים ריאגנטים.
| כמות | פריט |
| 1 | זכוכית מגובבים זכוכית מגובבים (לפחות 100 מ"ל גודל) |
| 20 | 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 1 | 10 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 4 | 25 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 2 | 50 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 1 | צנטריפוגה צינור מדף |
| 150 מ"ל | מים סטריליים די |
| 5 מ"ג | פולי-D- ליזין בקבוקון |
התחת = "jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1"> טבלה 3: אחסון בינוני ההכנה - רשימה של חומרים ריאגנטים.
| כמות | פריט |
| 44 מ"ל | DMEM עם צורה stablilzed של L- גלוטמין (ראה טבלה של חומרים) |
| 1 מ"ל | תוספת ללא תוסף לתרבית תאים עצביים (ראה טבלה של חומרים) |
| 2.5 מ"ל | סוס בסרום |
| 100 μL | חומצה אסקורבית [4 mg / mL] |
| 2.5 מ"ל | בסרום שור עוברית (FBS) |
| 0.5 מ"ל | Strep עט (אופציונלי) |
| 1 | 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 2 | 25 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 2 | 10 מ"ל פיפטה סטרלית סטרילית/ Td> |
| 2 | 1 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית |
| 1 | מסנן 250 מ"ל |
טבלה 4: הכנת DMEM 5/5 בינוני - רשימת חומרים ריאגנטים.
| כמות | פריט |
| 49 מ"ל | DMEM עם צורה stablilzed של L- גלוטמין (ראה טבלה של חומרים) |
| 1 מ"ל | תוספת ללא תוסף לתרבית תאים עצביים (ראה טבלה של חומרים) |
| 100 μL | חומצה אסקורבית [4 mg / mL] |
| 0.5 מ"ל | Strep עט (אופציונלי) |
| 1 | 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 2 | 25 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 2 | 1 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית |
| 1 | מסנן 250 מ"ל |
טבלה 5: DMEM + הכנה בינונית - רשימת חומרים ריאגנטים.
| כמות | פריט |
| 1 | פפאן 140 / בקבוקון |
| 1 | Dnase 1,260 U / בקבוקון |
| 7 מ"ל | DMEM + (מקורר) |
| 5 מ"ל | DMEM 5/5 (מחומם) |
| 10 μL | כחול טריפן |
| 2 | אזמלים |
| 1 | 35 מ"מ צלחת פטרי סטרילית |
| 4 | 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 2 | 5 מ"ל צינורות קריוגניים סטריליים |
| 2 | 2 מ"ל צינורות קריוגניים סטריליים |
| 1 | 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילית |
| 1 | צינור microcentrifuge |
| 2 | גדול נשא פיפטה העברה |
| 3 | קטן נשא פיפטה העברה |
| 5 | 2 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית - - |
| 5 | 1 מ"ל סטרילי פיפטה סטרילית |
| 2 | 10 μL טיפים micropipette סטרילי |
| 1 | 1000 μL טיפים micropipette סטרילי |
| 1 | שבב המוקיטומטר |
טבלה 6: דיסוציאציה של תאים - רשימת חומרים וריאגנטים.
Discussion
השלבים המתוארים בפרוטוקול זה לספק פירוט מספיק למתחילים לצלחת שלו / שלה תרבויות עצביים על MEAs להקליט פעילות הרשת. פרוטוקול זה יעזור להבטיח כי התרבויות לדבוק כראוי, יצירת שכבת השטיח של תאים מעל מערכי האלקטרודה, ולהישאר בריאים מזהמים בחינם במשך חודשים.
אמנם עדיף לדבוק בכל חלקי הפרוטוקול, ישנם שלבים לאורך כל התהליך, כי הם קריטיים לתוצאה מוצלחת. השימוש בטכניקה aseptic לאורך כל התהליך הוא הכרחי כדי למנוע את התרבויות מלהיות מזוהמים. חדש MEAs חייב להיעשות הידרופילי, כמתואר בפרוטוקול, או אחר הידבקות התא המסכן יביא. הימנעות pipetting קשה היווצרות בועות אוויר במהלך ניתוק תקטין את מספר תאים פגומים מצופה יוביל תשואה גבוהה ובריאה יותר. החל מ DMEM 5/5 ל DMEM + אחרי הראשוןהאכלה היא גם חשובה. DMEM 5/5 מכיל סרום סוס, אשר יגרום לתאי גלייה לשלוט על התרבות אם משתמשים ברציפות, וכתוצאה מכך פעילות העצבית המסכנה, למרות התרבויות יופיעו בריא 17 . האכלה תרבויות כמו מתוזמן ושמירה אותם בתנאים דוגרים ראוי גם חיוני.
ציפוי תרבויות תאים על MEAs כרוך במשתנים רבים שיכולים להוביל לתוצאות פחות אופטימליות. למרות המטרה היא "השטיח" המושלם של תאים, כישלון כתובת השלבים הקריטיים שהוזכרו לעיל תגרום התבגרות תאים עניים או זיהום. דבק התא המסכן, אשר שונה התבגרות התא המסכן, הוא גם דאגה. זה יכול להיגרם על ידי מספר גורמים, כולל הכנה MEA עניים לפני ציפוי או שימוש בינוני ישן. אם המדיום הישן המכיל צורה מיוצב של L- גלוטמין ותוספת ללא תוסף עבור תרבות תאים עצביים (ראה טבלת חומרים) משמש, התאים בתחילה לדבוק אבל אז לצוף משם אחרי כשבועיים. אם זיהום בקטריאלי הוא בעיה מתמשכת, ניתן להוסיף לאנטיביוטיקה, כגון אמפיצילין או סטר-פטר. יש גם קוטלי פטריות זמינים לטיפול זיהום פטרייתי. אלה הם חלק מהמשתנים הנפוצים יותר שיכולים להשפיע על התוצאה של התרבויות. ישנם רבים אחרים כי יהיה רק נתקל לאחר זמן וניסיון.
בהשוואה לשימוש microelectrodes זכוכית, טכניקה זו מצוינת ללימוד דינמיקה רשת ותגובות פרמקולוגיות. זה מאפשר את השימוש של דפוסי גירוי שונים- temporal שונים ומאפשר הקלטה של תגובות עצביים מאזורים מרובים בבת אחת. קבוצות קודמות הראו תוצאות מעניינות באמצעות פרוטוקולים דומים לאלה המתוארים כאן 18 . מאז תרבויות האחרון במשך שבועות או חודשים ואותן תרבויות ניתן לעשות בה שימוש חוזר, טכניקה זו גם אLlows עבור ניסויים מרובים לאורך זמן באותה רשת.
עם זאת, יש מגבלות על טכניקה זו. MEAs אינם פולשניים. לכן, הם יכולים רק להקליט פעילות חוץ תאית, לעומת הקלטה clamping או תאיים עם טפטפות. יתר על כן, מאז כל אלקטרודה במערך מכוסה על ידי תאים אחדים, לא ניתן לפתור את הפעילות של נוירון אחד. לעומת זאת, כי אלה הם תרבויות חוץ גופית , הם לא יכולים לשחזר באופן מלא את המאפיינים המבניים של רשתות במוח. כמו כן, הפעילות יכולה להיות מוקלט רק פחות מ -30 דקות בכל פעם, ללא מנגנון כלשהו לספק אווירה CO 2 עבור התאים כדי לשמור על איזון ה- pH שלהם.
לאחר טכניקה זו היא שולטת, מניפולציות תרופתי עם או ללא גירוי חשמלי ניתן לחקור. פרוטוקולים חדשים לבדיקת למידה והיווצרות זיכרון ברשתות עצביות יכולים גם להיות מתוכננים ונבדקים, יחד עם pרוקטולים לרשתות בהיפוקמפוס או בעמוד השדרה. פרוטוקולים לגירוי והכשרה של רשתות כבר פורסמו בעבר, וחלקם פותחו עוד לתוך פרוטוקולים vivo , כגון "הסתגלות סלקטיבית" המוצעים על ידי איתן et al. 19 . נבדקו מספר פרוטוקולים. עם זאת, רק תוצאות מתוך שינוי כדי טטנוס ההליך המוצע על ידי Ruaro בשנת 2005 מוצגים כאן 14 , 20 .
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע מענק CMMI-1300007. ברצוננו להכיר בחברי מעבדה קודמים, שסייעו בתכנון הפרוטוקולים הללו ובתחזוקת התרבויות במשך למעלה מחמש שנים באוניברסיטת ג'ורג 'מייסון: ד"ר ג'וזף פנקראציו, ד"ר חמיד צ'רקר, ד"ר גרטשן קנאק , ד"ר פרנץ המילטון, מייקל מאקורה ורוברט גרהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C.
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S.
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S.
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
