Quantifier la pigmentation abdominale dans<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Ce travail présente une méthode pour quantifier rapidement et précisément la pigmentation abdominale de Drosophila melanogaster en utilisant l'analyse d'image numérique . Cette méthode rationalise les procédures entre l'acquisition du phénotype et l'analyse des données et comprend le montage des échantillons, l'acquisition d'image, l'extraction de la valeur des pixels et la mesure des traits.
Abstract
La pigmentation est un trait morphologiquement simple mais très variable qui a souvent une signification adaptative. Il a largement servi de modèle pour la compréhension du développement et de l'évolution des phénotypes morphologiques. La pigmentation abdominale chez Drosophila melanogaster a été particulièrement utile, permettant aux chercheurs d'identifier les loci qui sous-tendent les variations inter-et intraspécifiques de la morphologie. Jusqu'à présent, cependant, la pigmentation abdominale de D. melanogaster a été largement analysée qualitativement, par marquage, plutôt que quantitativement, ce qui limite les formes d'analyse statistique qui peuvent être appliquées aux données de pigmentation. Ce travail décrit une nouvelle méthodologie qui permet de quantifier les différents aspects du modèle de pigmentation abdominale de D. melanogaster adulte. Le protocole comprend le montage d'échantillons, la capture d'image, l'extraction de données et l'analyse. Tous les logiciels utilisés pour la capture et l'analyse d'images sont des macrosÉcrit pour l'analyse d'image open source. L'avantage de cette approche est la capacité à mesurer précisément les traits de pigmentation en utilisant une méthodologie hautement reproductible sur différents systèmes d'imagerie. Bien que la technique ait été utilisée pour mesurer la variation des patrons de pigmentation tergale chez l'adulte D. melanogaster , la méthodologie est flexible et largement applicable aux modèles de pigmentation dans une multitude d'organismes différents.
Introduction
La pigmentation montre une énorme variation phénotypique entre les espèces, les populations et les individus, et même chez les individus pendant l'ontogenèse 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Bien qu'il existe une myriade d'études de pigmentation dans une grande variété d'animaux, la pigmentation a peut-être été mieux étudiée chez Drosophila melanogaster , où la pleine puissance de la génétique moléculaire a été utilisée pour élucider les mécanismes de développement et physiologiques qui régulent la pigmentation et la manière dont ces mécanismes évoluent 1 , 6 . On connaît beaucoup les gènes qui régulent la synthèse biochimique des pigments dans D. melanogaster 7 , 8 et les gènes qui contrôlent le diDistribution de cette biosynthèse 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . En outre, le cartographie génétique a identifié les loci génétiques sous-jacents aux différences intra-et interspécifiques de pigmentation dans D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Les relations entre la pigmentation et les traits pleiotropes, tels que le comportement 18 , 19 et l'immunité 19 , 20 , ont également été explorées, tout comme la signification adaptative des motifs de pigmentation 15 , 21 , 22 . En tant que tel, la pigmentation chez D. melanogaster a émergé comme un puissant mais simple mOdel pour le développement et l'évolution des phénotypes complexes.
La pigmentation chez l'adulte D. melanogaster se caractérise par des formes distinctes de mélanisation à travers le corps, en particulier sur les ailes et le thorax et l'abdomen dorsal. C'est la pigmentation de chaque plaque cuticulaire (tergite) sur l'abdomen dorsal, qui a reçu l'attention la plus recherchée. Il existe une variation considérable de cette pigmentation ( figure 1A- F ), à la fois à la fois génétique 17 , 23 et à l'environnement 24 , 25 facteurs. La cuticule d'un tergite abdominal est constituée de compartiments de développement antérieurs et postérieurs ( Figure 1G ), chacun pouvant être subdivisé en fonction de la pigmentation et de l'ornementation 26 . Le compartiment antérieur comprend six cuticulesTypes (a1-a6), et le compartiment postérieur comprend trois (p1-p3) ( figure 1G ). Parmi ceux-ci, les cuticules p1, p2 et a1 sont généralement pliées sous le tergite dans des abdomens non étirés, de sorte qu'ils sont cachés. La cuticule visible de manière fiable est caractérisée par une bande de pigmentation lourde, appelée ici «bande de pigment», composée de types de cuticules a4 (poilus à poils modérés) et a5 (poilus à gros poils), avec le bord postérieur de la bande Plus intensément pigmenté que le bord antérieur ( Figure 1G ). Avant cette bande est une région de cuticule velue légèrement pigmentée, qui a des poils postérieurement (a3) mais pas antérieurement (a2). La variation de la pigmentation entre les mouches est observée à la fois dans l'intensité de la pigmentation et dans la largeur de la bande de pigment. En général, la variation est plus élevée dans les segments les plus postérieurs (segments abdominaux 5, 6 et 7) et est plus faible dans les segments plus antérieurs (sécheresse abdominaleGentiment 3 et 4) 24 . En outre, il existe un dimorphisme sexuel dans la pigmentation de D. melanogaster , les mâles ayant généralement des cinquième et sixième tergites abdominaux entièrement pigmentés ( figure 4C ).
Dans la plupart des études de pigmentation abdominale chez D. melanogaster , la pigmentation a été traitée comme un trait catégorique ou ordinaire, le motif mesuré de manière qualitative 27 , 28 , 29 ou semi-quantitativement sur une échelle 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Ces méthodes souffrent inévitablement d'un manque de précision, et parce qu'elles dépendent de l'évaluation subjective de la pigmentation, il est difficile de comparer les données entre les études. Plusieurs auteurs ont quantifié les dimensions spatiales de la pigmentation 38 , 39 , l'intensité de la pigmentation d'un type cutané 23 , 25 , 39 , 40 ou l'intensité moyenne de la pigmentation à travers le tergite abdominal dans son ensemble 41 , 42 , 43 . Néanmoins, ces méthodes de quantification ne mesurent pas à la fois l'intensité et la répartition spatiale de la pigmentation abdominale simultanément et ne capturent donc pas les nuances de la variation de la pigmentation dans l'abdTergite terminale. En outre, plusieurs de ces méthodes de quantification 38 , 41 , 42 , 43 nécessitent la dissection et le montage de la cuticule abdominale. Cela prend du temps et détruit l'échantillon, ce qui rend indisponible pour des analyses morphologiques supplémentaires. À mesure que la compréhension du développement et de l'évolution de la pigmentation abdominale approfondit, des outils plus sophistiqués pour mesurer rapidement et précisément la répartition spatiale et l'intensité de la pigmentation seront nécessaires.
L'objectif global de cette méthode est d'utiliser l'analyse d'image numérique pour obtenir une mesure réplicable et plus précise de la pigmentation abdominale dans D. melanogaster . La méthodologie comprend trois étapes. Tout d'abord, la mouche adulte est montée de manière non destructive et une image numérique de l'abdomen dorsal est prise. Deuxièmement, en utilisant une macro ImageJ, l'utilisateurDéfinit une bande antérieure-postérieure de pixels qui s'étend de l'antérieur de la cuticule a2 à la postérieure de la cuticule a5 (boîte verte, figure 1G ) sur les troisième et quatrième segments abdominaux. La valeur moyenne des pixels sur la largeur de cette bande est ensuite extraite le long de son axe long, générant un profil qui capture la répartition spatiale et l'intensité de la pigmentation à mesure qu'elle change de l'antérieur à l'arrière du tergite. Troisièmement, un script R est utilisé pour décrire le profil de pigmentation mathématiquement à l'aide d'une cannelure cubique. Le script R utilise alors la spline et sa première et seconde dérivée pour extraire la largeur de la cuticule a2-a5, la largeur de la bande de pigment et les niveaux de pigmentation maximum et minimum. La méthode quantifie donc à la fois les caractéristiques spatiales et la profondeur de la pigmentation abdominale.
Cette méthodologie quantifie la pigmentation des troisième et quatrième tergites abdominales,Qui ont fait l'objet de nombreuses études précédentes 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , soit exclusivement, soit en combinaison avec d'autres tergites postérieures. Bien qu'il soit moins variable que les cinquième et sixième tergites abdominales, les troisième et quatrième tergites ne sont pas complètement pigmentés chez les mâles, donc ce protocole peut être appliqué chez les mâles et les femelles. Néanmoins, comme indiqué ici, le protocole peut être utilisé pour mesurer la pigmentation dans les cinquième et sixième tergites abdominales chez les femelles. En outre, des modifications mineures des scripts utilisés pour extraire les caractéristiques du profil de pigmentation devraient permettre d'utiliser la méthode pour quantifier la variation de pigmentation dans une grande variété d'autresorganismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthodologie permet l'acquisition précise, rapide et répétable de données de pigmentation sous une forme quantitative adaptée aux multiples analyses en aval. La méthode a été utilisée pour acquérir des données sur l'effet de la température sur la pigmentation abdominale dans une ligne isogénique de mouches. Cependant, la méthodologie pourrait être utilisée dans les études de génétique directe pour identifier les gènes qui sous-tendent les différences de pigmentation entre les individu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la National Science Foundation octroie à AWS IOS-1256565 et IOS-1557638. Nous remercions Patricia Wittkopp et trois critiques anonymes pour leurs commentaires utiles sur une version antérieure de cet article.
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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