Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Summary

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Abstract

sistemas de expresión de proteína heteróloga se utilizan para la producción de proteínas recombinantes, la interpretación de celular tráfico / localización, y la determinación de la función bioquímica de las proteínas a nivel de sub-organismo. Aunque los sistemas de expresión de baculovirus se utilizan cada vez más para la producción de proteínas en numerosos biotecnológica, farmacéutica y aplicaciones industriales, sistemas nonlytic que no implican infección viral tiene evidentes ventajas, pero a menudo se pasa por alto y poco utilizados. A continuación, describimos un método para generar vectores de expresión nonlytic y expresión de la proteína recombinante transitoria. Este protocolo permite la localización celular eficiente de proteínas recombinantes y se puede utilizar para discernir rápidamente el tráfico de proteínas dentro de la célula. Mostramos la expresión de cuatro proteínas recombinantes en una línea de células de insecto disponibles comercialmente, incluyendo dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci, asícomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para la membrana plasmática de la célula y para lisosomas intracelulares. Todas las proteínas recombinantes se produjeron como quimeras con marcadores de proteínas fluorescentes en sus extremos carboxilo, que permite la detección directa de las proteínas recombinantes. La doble transfección de células con plásmidos que albergan construcciones de los genes de interés y un marcador subcelular conocido permite para imágenes de células vivas y la mejora de validación de localización de la proteína celular.

Introduction

La producción de proteínas recombinantes utilizando sistemas de expresión de células de insectos ofrece numerosos beneficios para el estudio de proteínas eucarióticas. A saber, células de insectos poseen modificaciones similares después de la traducción, procesamiento, y los mecanismos de clasificación como los presentes en células de mamífero, lo que es ventajoso para la producción de proteínas correctamente plegadas ^{1, 2, 3.} Sistemas de células de insectos también típicamente requieren menos recursos y menos tiempo y esfuerzo para el mantenimiento de líneas celulares de mamífero ^{4, 5.} El sistema de expresión de baculovirus es un sistema basado en células de insectos de tal manera que ahora se utiliza ampliamente en muchas disciplinas, incluyendo la producción de proteínas recombinantes para la caracterización de proteínas y la terapéutica, la presentación inmunogénico de péptidos extraños y las proteínas virales para la producción de vacunas, la síntesis de múltiples complejos proteínicas, La producción de proteínas glicosiladas, etc. ^{1, 2, 4, 6.} Hay, sin embargo, situaciones en las que la expresión de baculovirus puede no ser aplicable ^{3, 7,} y el uso de sistemas de expresión de insectos nonlytic y transitorios pueden ser más apropiados. Específicamente, la expresión de células de insecto transitoria ofrece la posibilidad para la rápida síntesis de proteína recombinante, requiere menos desarrollo y mantenimiento, no implica la lisis celular viral impuesta, y proporciona un medio para estudiar mejor tráfico celular durante la síntesis de ^{7, 8, 9 proteínas, 10.}

Este protocolo describe la rápida generación de vectores de expresión utilizando extensión de solapamiento de dos etapas de PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 y el estándar de clonación de ADN de plásmido en Escherichia coli. Los plásmidos se utilizan para doble transfectar células de insecto cultivadas comercialmente disponibles y para producir proteínas representativas. El protocolo describe la producción y el uso de dos proteínas marcadoras subcelular marcados con fluorescencia diferentes y demuestra colocalización con dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci. El siguiente protocolo proporciona la metodología básica para OE-PCR, insecto mantenimiento de las células y la transfección, y microscopía de fluorescencia para la localización celular de proteínas diana.

Protocol

1. OE-PCR para la construcción de plásmidos de expresión Nota: Véase la Tabla 1 para todos los cebadores utilizados en OE-PCR. El uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad se recomienda para todas las amplificaciones. Sin embargo, debido a que estas enzimas con frecuencia no dejan un 3' A, es necesario realizar una breve no amplificar-incubación, con una ADN polimerasa Taq a productos 'A-cola' de la PCR antes de la clonación ellos en una expresión de célu…

Representative Results

OE-PCR OE-PCR permite la síntesis de los productos de ADN quiméricas que, una vez insertado en un vector de expresión, permitir la producción de proteínas quiméricas recombinantes correspondientes a cualquier gen de prueba de interés y la proteína de marcador fluorescente. La figura 1 representa un esquema general para la producción de vectores de expresión que contienen PIB B. tabaci acuaporin…

Discussion

Sistemas de expresión de proteínas heterólogas son herramientas importantes para la producción de proteínas recombinantes utilizadas en numerosas aplicaciones aguas abajo ^4. La elección de los diversos sistemas de expresión disponibles depende del objetivo final de la proteína de interés. Varios sistemas de expresión de células de insecto están disponibles que ofrecen alternativas flexibles para sistemas de expresión de células procariotas y eucariotas ^5,</sup…

Materials

KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605