Dette arbeidet beskriver en optimalisert metyl-CpG-bindingsdomene (MBD) sekvenseringsprotokoll og en beregningsrørledning for å identifisere differensielt metylerte CpG-rike regioner hos pasienter med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL).
Rollen av lange, ikke-kodende RNAer (lncRNAs) i kreft, kommer frem i forkant på grunn av økende interesse for å forstå deres mekaniske funksjoner under kreftutvikling og progresjon. Til tross for dette har den globale epigenetiske reguleringen av lncRNA og repetitive sekvenser i kreft ikke blitt godt undersøkt, særlig i kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Denne studien fokuserer på en unik tilnærming: immunpresipitasjonsbasert fangst av dobbeltstrengede, metylerte DNA-fragmenter ved bruk av metyl-bindende domene (MBD) proteiner, etterfulgt av neste generasjons sekvensering (MBD-seq). CLL pasientprøver som tilhørte to prognostiske undergrupper (5 IGVH-muterte prøver + 5 IGVH ikke-mutaterte prøver) ble brukt i denne studien. Analyse avslørte 5.800 hypermetylerte og 12.570 hypometylerte CLL-spesifikke differensielt metylerte gener (cllDMGs) sammenlignet med normale friske kontroller. Viktigst, disse resultatene identifiserte flere CLL-spesifikke, differensielt metylerte lncRNAer, rePetitive elementer og proteinkoding gener med potensiell prognostisk verdi. Dette arbeidet skisserer en detaljert protokoll for en MBD-seq og bioinformatikk pipeline utviklet for omfattende analyse av globale metyleringsprofiler i svært CpG-rik regioner ved bruk av CLL pasientprøver. Endelig ble et proteinkoding-gen og et lncRNA validert ved bruk av pyrosequensering, som er en svært kvantitativ metode for å analysere CpG-metyleringsnivåer for ytterligere å bekrefte funnene fra MBD-seq-protokollen.
Bruken av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å analysere globale DNA-metyleringsprofiler har blitt stadig mer populært de siste årene. Genome-brede metyleringsanalyser, inkludert mikroarray- og ikke-mikroarray-baserte metoder, ble utviklet basert på følgende: bisulfittomdannelsen av genomisk DNA, metyleringsfølsomme restriksjonsenzymfordøyninger og immunutfelling av metylert DNA ved bruk av metyl-CpG-spesifikke antistoffer .
Aberrant DNA-metylering er et kjennetegn ved leukemi og lymfomer, inkludert kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Tidligere har flere grupper inkludert vår karakterisert DNA-metyleringsprofilene av forskjellige CLL-prognostiske undergrupper og normale, sunne B-cellekontroller ved bruk av bisulfitt-omdannelsen av genomisk DNA, etterfulgt av mikromarbaserte metoder eller helgenomsekvenser 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfittomdannelsen av genomisk DNA fører til deaminering av umodifiserte cytosiner til uracil, hvilket etterlater de modifiserte metylerte cytosiner i genomet. Når de er omdannet, kan metyleringsstatusen til DNA'et bestemmes ved PCR-amplifisering og sekvensering under anvendelse av forskjellige kvantitative eller kvalitative metoder, som for eksempel mikromarraybasert eller helgenoms-bisulfitt-sekvensering (WGBS). Selv om bisulfitt-konverteringsbaserte metoder har mange fordeler og er mye brukt i forskjellige krefttyper for å analysere DNA-metyleringsnivåer, er det noen ulemper forbundet med denne teknikken. WGBS-sekvensering tillater enkelbasbasert oppløsning med lavere mengder DNA og er det beste egnet alternativet for å analysere et stort antall prøver. Imidlertid unnlater denne metoden å skille mellom modifikasjonene mellom 5mC og 5hmC nivåene i genomene 5 , 6 . I tillegg tilbyr ikke mikroarray-baserte metoder komplett cOverage av genomet.
I en nylig studie fra laboratoriet 7 ble immunoprecipitasjonsbaserte metoder, i stedet for bisulfittkonvertering, brukt til å identifisere svært CpG-rike, differensielt metylerte regioner i global skala hos CLL-pasienter og normale sunne kontroller. Inmethyl-CpG-bindende domene (MBD) neste generasjons sekvensering (MBD-seq) avhenger anrikningen av dobbeltstrenget fragmentert DNA av graden av CpG-metylering. Denne metoden kan overvinne ulempene ved bisulfitt-omdannelsesmetoden og kan også gi genomfattende dekning av CpG-metylering på en upartisk og PCR-uavhengig måte. I motsetning til bisulfitt-konverteringsbaserte mikroarray-metoder kan MBD-seq også brukes til å analysere metyleringsstatusen for repeterende elementer, for eksempel lange interspersed-kjernefysiske elementer (LINE), korte intersperserte kjernefysiske elementer (SINEs), lange terminale repetisjoner (LTRS), Etc. Imidlertid, sammenlignet med bisulfittomdannelsesmetoder,En MBD-seq-protokoll krever en relativt stor mengde inngangsd DNA. Også kvaliteten på sekvenseringen leser og dataene avhenger av spesifisitet, affinitet og kvalitet av antistoffene som anvendes.
Den nåværende studien forklarer en detaljert MBD-seq-protokoll for å berikke metylert DNA for neste generasjons sekvensering. Den bruker et kommersielt metylert DNA-bindingsberikningssett (oppført i Materialetabellen ), samt en beregningsrørledning for å visualisere og tolke metylerings-sekvenseringsdata for å identifisere CLL-spesifikke hyper- og hypomethylerte regioner sammenlignet med normale sunne kontroller. I utgangspunktet benytter denne metoden muligheten til MBD av humant MBD2-proteininteraksjon med metylerte CpGer for å ekstrahere DNA beriget med metylerte CpGer, og dette følges av høy gjennomstrømningssekvensering av metylert DNA.
MBD-seq er en kostnadseffektiv, immunprecipitasjonsbasert teknikk som kan brukes til å studere metyleringsmønstre med fullstendig gjennomsiktig dekning. Både MeDIP-seq (metylert DNA-immunutfelling etterfulgt av sekvensering) og MBD-seq resulterer i anrikning av CpG-rik metylert DNA. Imidlertid viser MBD-seq mer affinitet mot binding til høyt CpG-rik-regioner når sammenlignet med MeDIP-seq 19 . Ved å bruke et metylbindende anrikningssett kan man fraksjonere DNAet til høy CpG- og lav-CpG-rik…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Svenske Forskningsrådet, Svenske Kreftforeningen, Knut og Alice Wallenberg Foundation (KAW), og FoU VästraGötalandsregionen.
Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
Absolute Ethanol | Any company | ||
70% Ethanool | Any company | ||
DNAse free water | Milli Q | ||
DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
Water Bath | Grant | ||
Heat block | grant | ||
Tube rotater | Labquake |