Omfattende DNA-metyleringsanalyse ved bruk av en metyl-CpG-bindende domene-fangstbasert metode i kroniske lymfocytiske leukemi-pasienter

Summary

Dette arbeidet beskriver en optimalisert metyl-CpG-bindingsdomene (MBD) sekvenseringsprotokoll og en beregningsrørledning for å identifisere differensielt metylerte CpG-rike regioner hos pasienter med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL).

Abstract

Rollen av lange, ikke-kodende RNAer (lncRNAs) i kreft, kommer frem i forkant på grunn av økende interesse for å forstå deres mekaniske funksjoner under kreftutvikling og progresjon. Til tross for dette har den globale epigenetiske reguleringen av lncRNA og repetitive sekvenser i kreft ikke blitt godt undersøkt, særlig i kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Denne studien fokuserer på en unik tilnærming: immunpresipitasjonsbasert fangst av dobbeltstrengede, metylerte DNA-fragmenter ved bruk av metyl-bindende domene (MBD) proteiner, etterfulgt av neste generasjons sekvensering (MBD-seq). CLL pasientprøver som tilhørte to prognostiske undergrupper (5 IGVH-muterte prøver + 5 IGVH ikke-mutaterte prøver) ble brukt i denne studien. Analyse avslørte 5.800 hypermetylerte og 12.570 hypometylerte CLL-spesifikke differensielt metylerte gener (cllDMGs) sammenlignet med normale friske kontroller. Viktigst, disse resultatene identifiserte flere CLL-spesifikke, differensielt metylerte lncRNAer, rePetitive elementer og proteinkoding gener med potensiell prognostisk verdi. Dette arbeidet skisserer en detaljert protokoll for en MBD-seq og bioinformatikk pipeline utviklet for omfattende analyse av globale metyleringsprofiler i svært CpG-rik regioner ved bruk av CLL pasientprøver. Endelig ble et proteinkoding-gen og et lncRNA validert ved bruk av pyrosequensering, som er en svært kvantitativ metode for å analysere CpG-metyleringsnivåer for ytterligere å bekrefte funnene fra MBD-seq-protokollen.

Introduction

Bruken av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å analysere globale DNA-metyleringsprofiler har blitt stadig mer populært de siste årene. Genome-brede metyleringsanalyser, inkludert mikroarray- og ikke-mikroarray-baserte metoder, ble utviklet basert på følgende: bisulfittomdannelsen av genomisk DNA, metyleringsfølsomme restriksjonsenzymfordøyninger og immunutfelling av metylert DNA ved bruk av metyl-CpG-spesifikke antistoffer .

Aberrant DNA-metylering er et kjennetegn ved leukemi og lymfomer, inkludert kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Tidligere har flere grupper inkludert vår karakterisert DNA-metyleringsprofilene av forskjellige CLL-prognostiske undergrupper og normale, sunne B-cellekontroller ved bruk av bisulfitt-omdannelsen av genomisk DNA, etterfulgt av mikromarbaserte metoder eller helgenomsekvenser ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. Bisulfittomdannelsen av genomisk DNA fører til deaminering av umodifiserte cytosiner til uracil, hvilket etterlater de modifiserte metylerte cytosiner i genomet. Når de er omdannet, kan metyleringsstatusen til DNA'et bestemmes ved PCR-amplifisering og sekvensering under anvendelse av forskjellige kvantitative eller kvalitative metoder, som for eksempel mikromarraybasert eller helgenoms-bisulfitt-sekvensering (WGBS). Selv om bisulfitt-konverteringsbaserte metoder har mange fordeler og er mye brukt i forskjellige krefttyper for å analysere DNA-metyleringsnivåer, er det noen ulemper forbundet med denne teknikken. WGBS-sekvensering tillater enkelbasbasert oppløsning med lavere mengder DNA og er det beste egnet alternativet for å analysere et stort antall prøver. Imidlertid unnlater denne metoden å skille mellom modifikasjonene mellom 5mC og 5hmC nivåene i genomene ^{5 , 6} . I tillegg tilbyr ikke mikroarray-baserte metoder komplett cOverage av genomet.

I en nylig studie fra laboratoriet ⁷ ble immunoprecipitasjonsbaserte metoder, i stedet for bisulfittkonvertering, brukt til å identifisere svært CpG-rike, differensielt metylerte regioner i global skala hos CLL-pasienter og normale sunne kontroller. Inmethyl-CpG-bindende domene (MBD) neste generasjons sekvensering (MBD-seq) avhenger anrikningen av dobbeltstrenget fragmentert DNA av graden av CpG-metylering. Denne metoden kan overvinne ulempene ved bisulfitt-omdannelsesmetoden og kan også gi genomfattende dekning av CpG-metylering på en upartisk og PCR-uavhengig måte. I motsetning til bisulfitt-konverteringsbaserte mikroarray-metoder kan MBD-seq også brukes til å analysere metyleringsstatusen for repeterende elementer, for eksempel lange interspersed-kjernefysiske elementer (LINE), korte intersperserte kjernefysiske elementer (SINEs), lange terminale repetisjoner (LTRS), Etc. Imidlertid, sammenlignet med bisulfittomdannelsesmetoder,En MBD-seq-protokoll krever en relativt stor mengde inngangsd DNA. Også kvaliteten på sekvenseringen leser og dataene avhenger av spesifisitet, affinitet og kvalitet av antistoffene som anvendes.

Den nåværende studien forklarer en detaljert MBD-seq-protokoll for å berikke metylert DNA for neste generasjons sekvensering. Den bruker et kommersielt metylert DNA-bindingsberikningssett (oppført i Materialetabellen ), samt en beregningsrørledning for å visualisere og tolke metylerings-sekvenseringsdata for å identifisere CLL-spesifikke hyper- og hypomethylerte regioner sammenlignet med normale sunne kontroller. I utgangspunktet benytter denne metoden muligheten til MBD av humant MBD2-proteininteraksjon med metylerte CpGer for å ekstrahere DNA beriget med metylerte CpGer, og dette følges av høy gjennomstrømningssekvensering av metylert DNA.

Protocol

Den etiske godkjenningen for å samle CLL-prøvene er fra 2007-05-21, med følgende registreringsnummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL-pasienter ble diagnostisert i henhold til nylig revidert kriterium 8 , og prøvene ble samlet på diagnosetidspunktet. Pasientene i studien ble inkludert fra forskjellige hematologiavdelinger i den vestlige delen av Sverige etter skriftlig samtykke. Bare prøver av CLL perifert blodmononukleær celle (PBMC) med en tumorprosent av leukemic celler ≥70% ble valgt i …

Representative Results

MBD-seq ble nylig utført på CLL-pasienter og matchede, normale, sunne kontroller for å identifisere CLL-spesifikke differensielt hyper- og hypometylerte gener 7 . Den eksperimentelle og bioinformatiske rørledningen som brukes for å analysere dataene som er generert fra CLL og normale sunne prøver, er vist i figur 1A og 1B . Disse analysene identifiserte flere CLL-spesifikke differensielt metylerte regioner (cllD…

Discussion

MBD-seq er en kostnadseffektiv, immunprecipitasjonsbasert teknikk som kan brukes til å studere metyleringsmønstre med fullstendig gjennomsiktig dekning. Både MeDIP-seq (metylert DNA-immunutfelling etterfulgt av sekvensering) og MBD-seq resulterer i anrikning av CpG-rik metylert DNA. Imidlertid viser MBD-seq mer affinitet mot binding til høyt CpG-rik-regioner når sammenlignet med MeDIP-seq ¹⁹ . Ved å bruke et metylbindende anrikningssett kan man fraksjonere DNAet til høy CpG- og lav-CpG-rik…

Materials

Dneasy Blood and tissue kit	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D	1114544
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor standard sonication device	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml	Diagenode	C30010010-300
3 M Sodium acetate	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Agarose gels	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex mixer	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Any company
70% Ethanool	Any company
DNAse free water	Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5ml tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant
Tube rotater	Labquake