Summary

Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.

Abstract

De rol van lange noncoding RNAs (lncRNAs) bij kanker komt naar voren als gevolg van de groeiende interesse in het begrijpen van hun mechanistische functies tijdens de ontwikkeling van kanker en progressie. Desondanks is de globale epigenetische regulering van lncRNAs en repetitieve sequenties bij kanker niet goed onderzocht, vooral bij chronische lymfocytische leukemie (CLL). Deze studie richt zich op een unieke aanpak: de immunoprecipitatie-gebaseerde opname van dubbelstrengige, gemetileerde DNA-fragmenten met behulp van methyl-bindende domein (MBD) eiwitten, gevolgd door volgende generatie sequencing (MBD-seq). CLL patiëntenmonsters die behoren tot twee prognostische subgroepen (5 IGVH gemuteerde monsters + 5 IGVH niet gemuteerde monsters) werden in deze studie gebruikt. Analyse onthulde 5.800 hypermethylated en 12,570 hypomethylated CLL-specifieke differentieel gemethyleerde genen (cllDMGs) in vergelijking met normale gezonde controles. Het is belangrijk dat deze resultaten verschillende CLL-specifieke, differentieel gemethyleerde lncRNAs, opnieuw identificerenPetitieve elementen, en proteïne-coderende genen met potentiële prognostische waarde. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor een MBD-SEQ en bioinformatica pijpleiding die is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van globale methylatie profielen in zeer CpG rijke regio's met behulp van CLL patiëntenmonsters. Tenslotte werden een proteïne coderend gen en een lncRNA gevalideerd met behulp van pyrosequencing, welke een zeer kwantitatieve methode is om CpG methyleringsniveaus te analyseren om de bevindingen verder te bevestigen uit het MBD-seq protocol.

Introduction

Het gebruik van volgende generatie sequencing technieken om globale DNA-methylering profielen te analyseren is in de afgelopen jaren steeds populairder geworden. Genoom-brede methyleringsbepalingen, met inbegrip van microarray- en niet-microarray gebaseerde methoden, werden ontwikkeld op basis van het volgende: de bisulfietomzetting van genomisch DNA, methylatiegevoelige restrictie-enzymverdigingen en de immunoprecipitatie van gemethyleerd DNA onder gebruikmaking van methyl-CpG-specifieke antilichamen .

Aberrant DNA methylering is een van de kenmerken van leukemie en lymfomen, waaronder chronische lymfocytische leukemie (CLL). Vroeger hebben verschillende groepen, waaronder onze, de DNA-methyleringsprofielen van verschillende CLL-prognostische subgroepen en normale, gezonde B-celcontroles gekenmerkt door gebruik te maken van de bisulfietomzetting van genomisch DNA, gevolgd door micro-array-gebaseerde methoden of sequentiebepaling van het genoom-genoom 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. De bisulfietomzetting van genomisch DNA leidt tot de deaminatie van ongewijzigde cytosinen naar uracil, waardoor de gemodificeerde methylated cytosines in het genoom verlaten worden. Zodra geconverteerd kan de methyleringsstatus van het DNA bepaald worden door PCR amplificatie en sequentiebepaling onder toepassing van verschillende kwantitatieve of kwalitatieve methoden, zoals micro-array-gebaseerde of full-genome bisulfiet sequencing (WGBS). Hoewel bisulfietomzetting gebaseerde methoden veel voordelen hebben en veel gebruikt worden in verschillende kankersoorten om DNA-methyleringsniveaus te analyseren, zijn er een paar nadelen verbonden aan deze techniek. WGBS sequencing maakt het mogelijk om single-base pair resolutie met lagere hoeveelheden DNA en is de beste geschikte optie voor het analyseren van een groot aantal monsters. Echter, deze methode slaat er niet in om de wijzigingen tussen de 5 mC en 5 hmC niveaus in het genoom 5 , 6 te differentiëren. Bovendien bieden microarray-gebaseerde methoden geen complete cOverage van het genoom.

In een recente studie uit ons laboratorium 7 werden immunoprecipitatie gebaseerde methoden, in plaats van bisulfietomzetting, gebruikt om zeer CpG-rijke, differentieel gemetileerde regio's op wereldwijde schaal te identificeren bij CLL-patiënten en normale gezonde controles. Inmethyl-CpG-bindende domein (MBD) sequentiebepaling van volgende generatie (MBD-seq), is de verrijking van dubbelstrengs gefragmenteerd DNA afhankelijk van de mate van CpG-methylering. Deze methode kan de nadelen van de bisulfietomzettingsmethode overwinnen en kan ook genoom-brede dekking van CpG-methylering op een onbevooroordeelde en PCR-onafhankelijke wijze verschaffen. Bovendien kan MBD-seq, in tegenstelling tot bisulfietomzettingsgebaseerde microarraymethoden, worden gebruikt om de methyleringsstatus van herhalende elementen te analyseren, zoals langdurige kernelementen (LINE's), korte interversionele kernelementen (SINE's), lange terminale herhalingen (LTRS), Enz . In vergelijking met bisulfietomzettingsmethoden,Een MBD-seq protocol vereist een relatief grote hoeveelheid input DNA. Ook leest de kwaliteit van de sequentie en de gegevens zijn afhankelijk van de specificiteit, affiniteit en kwaliteit van de gebruikte antilichamen.

De huidige studie legt een gedetailleerd MBD-seq protocol uit om methylated DNA te verrijken voor de volgende generatie sequencing. Het gebruikt een commerciële methylated DNA binding verrijkingskit (vermeld in de Material Table ), evenals een berekeningspijpleiding om de methylering sequencing data te visualiseren en te interpreteren om CLL-specifieke hyper- en hypomethylated gebieden te identificeren in vergelijking met normale gezonde controles. In principe maakt deze methode gebruik van het vermogen van de MBD van de menselijke MBD2-eiwitinteractie met gemethyleerde CpG's om DNA te verrijken verrijkt met gemethyleerde CpG's, en dit wordt gevolgd door de high-throughput sequencing van gemethyleerd DNA.

Protocol

De ethische goedkeuring voor het verzamelen van de CLL-monsters is vanaf 2007-05-21, met het volgende registratienummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL patiënten werden gediagnosticeerd volgens recentelijk gewijzigde criteria 8 , en de monsters werden verzameld op het moment van diagnose. De patiënten in de studie werden opgenomen uit verschillende hematologieafdelingen in het westelijke deel van Zweden na schriftelijke toestemming. Alleen in deze studie werden alleen monsters van CLL perifere bl…

Representative Results

MBD-seq werd recentelijk uitgevoerd op CLL-patiënten en gecombineerde, normale, gezonde controles om CLL-specifieke differentieel hyper- en hypomethyleerde genen te identificeren 7 . De experimentele en bioinformatische pijpleiding die wordt gebruikt voor het analyseren van de gegevens die worden gegenereerd uit CLL en normale gezonde monsters, worden getoond in Figuur 1A en 1B . Deze analyses identificeerden verschi…

Discussion

MBD-seq is een kosteneffectieve, immunoprecipitatie-gebaseerde techniek die gebruikt kan worden om methylatiepatronen te bestuderen met volledige genoombrede dekking. Zowel MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitatie gevolgd door sequencing) en MBD-seq resulteren in de verrijking van CpG-rich methylated DNA. MBD-SEQ toont echter meer affiniteit naar binding aan zeer CpG-rijke gebieden wanneer vergeleken met MeDIP SEQ 19 . Met behulp van een methylbindende verrijkingskit kan men het DNA fractione…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, de Zweedse Kankervereniging, de Knut en Alice Wallenberg Stichting (KAW), en de Rekenkamer VästraGötalandsregionen.

Materials

Dneasy Blood and tissue kit Qaigen 69504
Lymphoprep solution A X I S-S H I E L D 1114544
Nano drop 2000 Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8 Sigma aldrich 93283
Bioruptor standard sonication device Diagenode UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml Diagenode C30010010-300
3 M Sodium acetate Diagenode C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit Thermo Fischersceintific G6465EU
E-gel 2% Agarose gels Thermo Fischersceintific G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit Thermo Fischersceintific ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators Thermo Fischersceintific 415110
Dynal MPC-S Thermo Fischersceintific A13346
Vortex mixer VWR 12620-848
Absolute Ethanol Any company
70% Ethanool Any company
DNAse free water Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate) Diagenode C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fischersceintific Q32851
Qubit 0.5ml tubes Thermo Fischersceintific Q32856
Qubit Thermo Fischersceintific Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform Illumina
Water  Bath Grant
Heat block grant
Tube rotater Labquake

References

  1. Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
  2. Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
  3. Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
  4. Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
  5. Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
  6. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  7. Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
  8. Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
  9. De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
  10. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  11. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  12. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  14. Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
  15. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  16. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  17. Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
  18. Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
  19. Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).

Play Video

Cite This Article
Subhash, S., Kanduri, M. Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients. J. Vis. Exp. (124), e55773, doi:10.3791/55773 (2017).

View Video