Omfattande DNA-metyleringsanalys med användning av en metyl-CpG-bindande domänfångningsbaserad metod i patienter med kronisk lymfocytisk leukemi
Summary
Detta arbete beskriver ett optimerat metyl-CpG-bindningsdomän (MBD) sekvenseringsprotokoll och en beräkningsrörledning för identifiering av differentiellt metylerade CpG-rika regioner hos patienter med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL).
Abstract
Rollen av långa icke-kodande RNA (lncRNA) i cancer kommer fram i framkant på grund av ökat intresse för att förstå deras mekaniska funktioner under cancerutveckling och progression. Trots detta har den globala epigenetiska förordningen av lncRNA och repetitiva sekvenser i cancer inte undersökts väl, särskilt vid kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Denna studie fokuserar på ett unikt förhållningssätt: den immunprecipitationsbaserade infångningen av dubbelsträngade, metylerade DNA-fragment med användning av metyl-bindande domän (MBD) proteiner följt av nästa generations sekvensering (MBD-seq). CLL-patientprover som tillhörde två prognostiska undergrupper (5 IGVH-muterade prover + 5 IGVH-omuterade prover) användes i denna studie. Analys avslöjade 5 800 hypermetylerade och 12 570 hypometylerade CLL-specifika differentiellt metylerade gener (cllDMG) jämfört med normala friska kontroller. Viktigt är att dessa resultat identifierade flera CLL-specifika, differentiellt metylerade lncRNA, rePetitiva element och proteinkodande gener med potentiellt prognostiskt värde. I detta arbete beskrivs ett detaljerat protokoll för en MBD-seq- och bioinformatikpipeline som utvecklats för en omfattande analys av globala metyleringsprofiler i hög CpG-rika regioner med användning av CLL-patientprover. Slutligen validerades en proteinkodande gen och ett lncRNA med användning av pyro-sekvensering, vilket är en högt kvantitativ metod för att analysera CpG-metyleringsnivåer för att ytterligare bekräfta resultaten från MBD-seq-protokollet.
Introduction
Användningen av nästa generationens sekvenseringsteknik för att analysera globala DNA-metyleringsprofiler har blivit allt populärare under de senaste åren. Genomövergripande metyleringsanalyser, innefattande mikroarray- och icke-mikroarraybaserade metoder, utvecklades baserat på följande: bisulfitomvandlingen av genomiskt DNA, metyleringskänslig restriktionsenzym-digestioner och immunutfällningen av metylerat DNA med användning av metyl-CpG-specifika antikroppar .
Aberrant DNA-metylering är en av kännetecknen för leukemi och lymfom, inklusive kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Tidigare har flera grupper, inklusive våra, karakteriserat DNA-metyleringsprofilerna för olika CLL-prognostiska undergrupper och normala, hälsosamma B-cellkontroller med användning av bisulfitomvandlingen av genom-DNA, följt av mikrometrisbaserade metoder eller genom genomsekvenser 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfitomvandlingen av genomiskt DNA leder till deaminering av omodifierade cytosiner till uracil, vilket lämnar de modifierade metylerade cytosinerna i genomet. När omvandlad kan DNA-metyleringsstatusen bestämmas genom PCR-amplifiering och sekvensering med användning av olika kvantitativa eller kvalitativa metoder, såsom mikrometrisbaserad eller helgenoms-bisulfit-sekvensering (WGBS). Även om bisulfitkonverteringsbaserade metoder har många fördelar och används ofta i olika cancertyper för att analysera DNA-metyleringsnivåer, finns det några nackdelar associerade med denna teknik. WGBS-sekvensering möjliggör enkelbasbaserad upplösning med lägre mängder DNA och är det bästa lämpliga alternativet för att analysera ett stort antal prover. Emellertid misslyckas denna metod att differentiera modifieringarna mellan 5 mC och 5 hmC-nivåerna i genomet 5 , 6 . Dessutom erbjuder microarray-baserade metoder inte komplett cOverage av genomet.
I en nyligen genomförd studie från vårt laboratorium 7 användes immunprecipitationsbaserade metoder, snarare än bisulfitkonvertering, för att identifiera högt CpG-rika, differentiellt metylerade regioner i global skala hos CLL-patienter och normala friska kontroller. Inmetyl-CpG-bindande domän (MBD) nästa generations-sekvensering (MBD-seq) beror anrikningen av dubbelsträngat fragmenterat DNA på graden av CpG-metylering. Denna metod kan övervinna nackdelarna med bisulfitomvandlingsmetoden och kan även tillhandahålla genomomsättning av CpG-metylering på ett opartiskt och PCR-oberoende sätt. Dessutom kan MBD-seq, till skillnad från bisulfitkonverteringsbaserade mikroarraymetoder, användas för att analysera metyleringsstatus för repetitiva element, såsom långa interspersed-kärnämnen (LINE), korta interspersed-kärnämnen (SINE), långa terminala upprepningar (LTRS), Etc. Emellertid, jämfört med bisulfitomvandlingsmetoder,Ett MBD-seq-protokoll kräver en relativt stor mängd inmatnings-DNA. Kvaliteten på sekvenseringen läser också och data beror på specificiteten, affiniteten och kvaliteten på antikropparna som används.
Den aktuella studien förklarar ett detaljerat MBD-seq-protokoll för berikning av metylerat DNA för nästa generations sekvensering. Den använder ett kommersiellt metylerat DNA-bindande anriknings kit (listat i materialtabellen ), liksom en beräkningsrörledning för att visualisera och tolka metyleringssekvenseringsdata för att identifiera CLL-specifika hyper- och hypometylerade regioner jämfört med normala friska kontroller. I grund och botten utnyttjar denna metod förmågan hos MBD för humant MBD2-proteininteraktion med metylerade CpGs för att extrahera DNA som är berikat med metylerade CpG, och detta följs av hög genomströmnings-sekvensering av metylerat DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq är en kostnadseffektiv, immunutfällningsbaserad teknik som kan användas för att studera metyleringsmönster med fullständig genomomsättning. Både MeDIP-seq (metylerad DNA-immunutfällning följt av sekvensering) och MBD-seq resulterar i anrikning av CpG-rik metylerad DNA. Emellertid visar MBD-seq mer affinitet mot bindning till starkt CpG-riksområden när man jämfört med MeDIP-sekvens 19 . Med användning av ett metylbindande anriknings-kit kan man fraktionera DNA-en till hög C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av Vetenskapsrådet, Kräftsamhället, Knut- och Alice Wallenbergstiftelsen (KAW) och Västra Götalandsregionen.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
