유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리
Summary
수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.
Abstract
신경 퇴행성 질환은 종종 영향을받는 사람들에게 치명적인 영향을 미칩니다. 망막 신경절 세포 (RGC)의 소실은 정상적인 노화뿐만 아니라 당뇨 망막 병증 및 녹내장을 비롯한 여러 질병에 영향을 미친다. RGC의 중요성에도 불구하고 RGC는 지금까지 부분적으로 망막의 다양한 세포 중 일부만으로 구성되어 있기 때문에 지금까지 연구하기가 극도로 어려웠습니다. 또한, 현재의 분리 방법은 세포 내 마커를 사용하여 비 생존 세포를 생성하는 RGC를 확인합니다. 또한 이러한 기술에는 긴 격리 프로토콜이 필요하므로 RGC를 얻고 분리하기위한 실용적이고 표준화 된 신뢰할 수있는 방법이 부족합니다. 이 연구는 양성 및 음성 선택 기준 모두에 근거한 프로토콜을 사용하여 생쥐 망막에서 주요 RGC를 분리하는 효율적이고 포괄적이며 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 장래의 RGC에 대한 연구를 허용하며,신경 퇴행성 질환에서 기능성 RGC의 손실로 인한 시력 감소.
Introduction
RGC는 말단 분화 된 뉴런이므로 일차 세포가 실험에 필요합니다. 일차 생쥐 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리 및 농축을위한 프로토콜의 개발은 시험 관내에서 RGC 건강 및 변성의 기전을 밝히는 데있어 기본적이다. 이것은 RGC 기능을 촉진하고 사망을 최소화 할 수있는 잠재적 인 치료법을 개발하려는 연구에 특히 중요합니다. RGC의 퇴행은 녹내장, 당뇨 망막 병증 및 정상 노화와 같은 망막 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. RGC 소실의 원인이되는 특정 세포 기전이 불분명하지만 일련의 위험 요소가 확인되었습니다. 시신경 머리 1 , 2 , 3 에서 산소가 부족하면 RGC가 사망하고 4 , 흥분제와 i의 활성화 사이의 항상성의 교란으로 작용합니다개별 RGC 5,6 내의 억제 수용체. 일련의 과제는 심층 연구를 위해 이러한 세포의 사용에 대한 진전을 방해합니다. 첫째, 쥐 망막에 존재하는 RGC의 수가 적습니다. RGCs는 총 망막 세포 7 , 8 , 9 의 1 % 미만을 차지합니다. 둘째, 대부분의 RGC 특이적인 마커는 세포 내 단백질 10 , 11 , 12 입니다. 이러한 마커를 기반으로 한 선택은 세포를 비 생존 가능 상태로 남겨 두어 다운 스트림 기능 분석을 배제합니다. 마지막으로, 현재 사용 가능한 프로토콜은 길고 표준화가 부족합니다 13 , 14 . 조기 RGC 격리 프로토콜은 면역 주사 방법에 기반을 두었습니다. Barres et al. 15 명 고전적인 면역 반응을 적응시켰다.anning 기술을 사용하여 세포 표면 마커 인 항 – 흉선 세포 항원 (Thy1)에 면역 반응을 일으키는 양성 선별 이전에 망막 세포에서 단구 및 내피 세포를 배제한 두 번째 단계를 추가했다. 몇 년 후, 홍 외 ( Hong et al. 셀 구분 전략과 결합 된 자기 비드 분리 기술을 통해 고순도의 RGCs를 분리합니다. 자성 비드의 사용은 여전히 많은 과학적 응용 분야에서 사용되고 있습니다. 함께, 자기 구슬 및 유동 세포 계측법 프로토콜은 분리 된 세포의 순도를 향상시켰다. 그러나, 이러한 정제 시스템은 해리 된 망막으로부터 쥐 RGC를 단리하기 위해 아직 표준화되지 않았다.
유동 세포 계측법은 세포 현탁액의 광학 및 형광 특성을 측정하는 강력한 분석 방법입니다. 세포는 높은 수준의 감도로 정량적으로 및 질적으로 분석되어 세포 집단에 대한 다차원 분석을 제공한다ation. 세포 분별은 두 가지 주요 물리적 특성, 즉 세포 크기 또는 표면적 및 입상 성 또는 내부 복잡성에 기초합니다. 유사한 여기 파장 및 상이한 방출을 갖는 형광색으로 표지 된 항체를 조합함으로써 다차원 분석을 수행 할 수있다. 유세포 분석은 빠르고, 재현성 있고, 민감합니다. Multitpe 레이저는 유동 세포 계측법에 의한 단일 세포의 다차원 분석을 훨씬 더 허용합니다. 따라서, 그것은 세포 표본의 연구를위한 매력적인 방법론입니다. Fluorescence activated cell sorting (FACS)은 유동 세포 계측법으로 확인 된 다차원 적 표현형 차이를 이용하여 개개의 세포를 별개의 하위 집단으로 분류합니다.
지난 10 년 동안 다중 표면 및 세포 내 단백질이 뉴런을 포함한 세포 선택을위한 잠재적 바이오 마커로 확인되었습니다. 쥐에서 RGC를 분리하려고했던 초기 연구는 Thy1을 신경절 세포로 사용했습니다마커. 불행히도 Thy1은 CD90으로, 다른 설치류 종 18 , 19 , 20에 여러 개의 isoform을 가지고 있으며 여러 망막 세포 유형 19 , 20에 의해 발현되어 RGC의 비 특이성 마커가됩니다. 또 다른 표면 마커 인 CD48은 대 식세포와 소교암을 포함하여 망막의 단핵 세포 집단에서 발견됩니다. 이 두 가지 표면 마커를 사용하여 변형 된 RGC 시그니처 Thy1 + 및 CD48 네거티브 세포가 개발되었습니다 ( 15 , 16 , 21 , 22) . 불행하게도,이 두 가지 선택 기준은 고도로 농축 된 RGC 개체군을 선택하기에 충분하지 않습니다. 이러한 충족되지 못한 요구를 해결하기 위해 다층 양성 및 음성 선택 기준에 기반한 유동 세포 계측 프로토콜이 개발되었습니다1 차 쥐 RGC를 풍부하게하고 정제하기 위해 알려진 세포 표면 마커.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS는 세포 집단을 정제하는 기술입니다. 다른 단리 방법으로는 면역 주사, 자성 비드 및 보체 고정 고갈이 있습니다. 이러한 다른 방법론에 비해 FACS의 장점은 다양한 강도의 강도를 가진 세포 표면 마커의 동시 식별에 기반합니다. 분자의 형광 강도는 단백질 발현 양에 비례합니다. 지금까지 RGC의 분리는 사용 된 격리 방법에 관계없이 Thy1 (CD90) 양성 및 CD48 음성성 15 , <s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 비디오 지원을 위해 미생물학, 미생물학 및 생화학 분야의 선임 일러스트 레이터 Tim Higgins 씨에게 감사드립니다. Matthew W. Wilson 박사와 Jablonski 및 Morales-Tirado 연구소의 토론에 도움을 주셨습니다. 이 작품은 Alcon Research Institute의 Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T)의 지원을 받았다. Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), 국방부 육군 의학 연구 및 재료 명령 (VMM-T), 실명 예방을위한 연구로부터의 무제한 보조금.
Materials
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neurosciences. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
