Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra
Summary
Inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de los microtúbulos en el cerebro en desarrollo del pez cebra se describen los métodos, que son ampliamente aplicables a otros tejidos. El primer protocolo describe un método optimizado de inmunomarcación microtúbulos estables y dinámicos. El segundo protocolo proporciona un método para la imagen y cuantificar nacientes microtúbulos específicamente.
Abstract
Microtúbulos (MTs) son dinámicas y frágiles estructuras que son un reto a la imagen en vivo, particularmente en embriones de vertebrados. Aquí se describen los métodos de inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de MTs en el tubo neural en desarrollo del embrión de pez cebra. Mientras el foco está en tejido neural, esta metodología es ampliamente aplicable a otros tejidos. Los procedimientos están optimizados para temprano a embriones en fase mediados somitogenesis (1 somite a 12 somitas), sin embargo se pueden adaptar a una amplia gama de otras etapas con ajustes relativamente menores. El primer protocolo proporciona un método para evaluar la distribución espacial de MTs estables y dinámicos y realizar un análisis cuantitativo de estas poblaciones con software de procesamiento de imagen. Este enfoque complementa las herramientas existentes para imagen microtúbulos dinámica y distribución en tiempo real, usa líneas transgénicas o la expresión transitoria de construcciones etiquetadas. De hecho, estas herramientas son muy útiles, sin embargo no distingue fácilmente entre MTs dinámicos y estables. La capacidad de la imagen y analizar estas poblaciones distintos microtúbulos tiene importantes implicaciones para los mecanismos de comprensión polarización celular y la morfogénesis. El segundo protocolo describe una técnica para analizar específicamente nacientes MTs. Esto se logra mediante la captura de las propiedades de crecimiento de novo de MTs en el tiempo, siguiendo la despolimerización de microtúbulos con el nocodazole drogas y un período de recuperación después de lavado de drogas. Esta técnica no se ha aplicado al estudio de MTs en embriones de pez cebra, pero es un valioso análisis para investigar la función en vivo de proteínas implicadas en el montaje del microtubule.
Introduction
Los microtúbulos (MTs) son polímeros de α – y β-tubulina que montar en protofilaments lineal, varios de los cuales se combinan para formar un tubo hueco1,2. MTs son estructuras polarizadas, con rápido crecimiento más extremos y de crecimiento lento menos extremos que están anclados en el centrosoma o de organización de microtúbulos centro (MTOC)3. De novo Formación de MT es iniciada por nucleación en el complejo de anillo de γ-tubulina (γ-TURC), que proporciona una plantilla para montaje MT4. En cualquier célula dada, dos poblaciones de MTs se pueden distinguir a su vez sobre a diferentes velocidades. Dinámicas MTs exploran su entorno celular por la conmutación entre las fases de crecimiento y contracción en un proceso conocido como inestabilidad dinámica5. A diferencia de dinámicas MTs, MTs estables son adultos y tienen una vida media más larga que la dinámica de MTs6.
Décadas de investigación en biología celular ha proporcionado un conjunto sofisticado de herramientas para el estudio de la función y la estructura de MT y dio lugar a un gran cuerpo de conocimiento sobre estos elementos citoesqueléticos. Por ejemplo, MTs juegan un papel central en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular, que es atribuible no sólo a su polaridad intrínseca, sino también a la distribución subcelular diferencial estable versus dinámica MTs7, 8. en cambio, mucho menos se entiende sobre MT arquitectura y función en entornos más complejos tridimensionales (3D), como el embrión de vertebrados, en parte debido al desafío de citoesqueleto MT en alta resolución de imagen. A pesar de esta limitación, la reciente generación de transgénico GFP-expresando las líneas eso etiqueta MTs o expresión transitoria de fluorescencia etiquetada MT marcadores ha aumentado nuestra comprensión de los cambios dinámicos que MTs y su celular y papel del desarrollo en el embrión de pez cebra. Toda la red de MT puede ser reflejada en líneas transgénicas en que tubulina es directamente etiquetados polímeros9 o tubulina indirectamente están etiquetados con las proteínas asociadas a MT Doublecortin como cinasa (Dclk) o Ensconsin (EMTB)10, 11. Se han generado otras líneas (y construcciones) que permiten una evaluación de polaridad intrínseca MT al etiquetado específicamente MT más extremos o centrosoma anclado menos extremos11,12,13, 14. el poder de estas herramientas reside en la capacidad para estudiar la dinámica de la MT en vivo, desarrollo de organismos. Estos estudios han puesto de manifiesto, por ejemplo, la distribución espacial y dinámica de MTs en poblaciones celulares específicas, la orientación de mitotic husos en tejidos sometidos a morfogénesis (un indicador del plano de división celular), la polaridad del polímero MT lo que se refiere a procesos tales como la elongación celular y la migración y tasa de crecimiento de MT determinada por cometa velocidad9,13,15. La limitación de estas herramientas es que ellos no fácilmente discriminar entre poblaciones de MT estables y dinámicas.
A partir de la literatura de biología celular rico, inmunomarcación imagen de MTs estables y dinámicos en el embrión del pez cebra se describen los métodos, que son complementarios al uso de líneas transgénicas. El uso generalizado de tales métodos de inmunomarcación en el pez cebra ha sido un poco obstaculizado por la dificultad de preservar la integridad de MT durante el procedimiento de fijación. 1 Protocolo describe un método optimizado para inmunomarcación total, dinámica, y estables MTs en las secciones del cerebelo en desarrollo del pez cebra. Además, un método sencillo usando comercialmente el software disponible se describe para cuantificar las poblaciones de MT. Estables MTs se distinguen de MTs dinámicos basados en varias modificaciones poste-de translación de la α-tubulina, como la acetilación y detyrosination, que se acumulan de MTs estables largo tiempo16,17. En el embrión de pez cebra, la acetilación se produce MTs ciliares y axonales pero no estable interfase MTs18, limitando la utilidad de este marcador a un subconjunto de estabilizado MTs. En cambio, detyrosination parece ocurrir sobre todo estables MTs en el embrión de pez cebra18. Esta modificación poste-de translación expone el ácido glutámico de carboxi-terminal de α-tubulina (tubulina detyrosinated)18 y puede ser detectada utilizando anti-Glu-tubulina19. Aunque detyrosination se produce preferentemente en MTs estables, la evidencia experimental indica que esta modificación poste-de translación es el resultado de, en lugar de una causa de estabilidad MT16. Se distingue la población MT recíproca, compuesto por dinámicos MTs, usando un anticuerpo, anti-Tyr-tubulina, que reconoce específicamente la forma de tyrosinated de α-tubulina19. Después de inmunomarcación con estos marcadores y la proyección de imagen confocal, el análisis cuantitativo de MTs (longitud, número y abundancia relativa) puede realizarse en regiones definidas del tubo neural en desarrollo. Para realizar este análisis utilizando software de procesamiento de imágenes 3D se facilita un método racionalizado. Este método puede ser aplicado para resolver las preguntas con respecto a la morfogénesis y el establecimiento o la maduración de la célula polaridad20. De hecho, la elaboración de matrices polarizados de MTs estables acompaña a muchos eventos del desarrollo, incluyendo fotorreceptor morfogénesis21, epitelización de las células en el desarrollo neural tubo18 y axón formación8.
Protocolo n ° 2 describe una adaptación en vivo de un ensayo de Biología de la célula para analizar MTs durante su Asamblea fase (nucleación/anclaje y crecimiento)22,23. Nacientes MTs están nucleadas en el centrosoma y posteriormente ancladas a subdistal apéndices del centriolo madre23. Se describe un método para analizar el incipiente rebrote MT después de despolimerización. Este protocolo proporciona detalles sobre el tratamiento del nocodazole a despolimerizar MTs, el procedimiento de lavado de la droga y el período de recuperación después del tratamiento. MT re-crecimiento se controla a intervalos regulareslavado de post s por inmunomarcación con marcadores para MTs totales (anti β-tubulina) junto con marcadores para el centrosoma (anti γ-tubulina) y núcleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), según los procedimientos generales descritos en el Protocolo 1. El paso de la despolimerización de MT de este protocolo es esencial ya que permite la evaluación del crecimiento de MT de novo en lugar de extensión de MTs preexistentes. Esta técnica es por lo tanto distinta de los otros procedimientos publicados para medir las tasas de crecimiento de MT (en ausencia de despolimerización) mediante el uso de un marcador de punta más como fin vinculante proteínas 3 fusionado a la proteína verde fluorescente (EB3-GFP), como se muestra en Tran et al., 201211. Además, este análisis es particularmente útil para el análisis de embriones defectuosos en Asamblea de novo MT, como los mutantes previamente divulgados de NEDD1 en el que se deteriora el reclutamiento de γ-tubulina en el centrosoma, dando por resultado incompleto formación del tubo neural y defectos neuronales24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actualmente existen muchos métodos para la proyección de imagen dinámica del MT en el desarrollo temprano del pez cebra, que van desde imágenes directo de moléculas etiquetadas inmunomarcación de fijo tejido11,12,13,14. Aunque MTs en una sola célula pueden existir en Estados estables o dinámicos, epitelización es un proceso en el cual MTs se estabilizan progresivamente con el tiempo. U…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El microscopio confocal fue adquirido con fondos de Estados Unidos National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. La investigación fue apoyada por los Estados Unidos nacional institutos de salud nacional Instituto de General ciencias médicas (NIH/NIGMS) grant #GM085290 y los Estados Unidos Departamento de defensa (DOD) grant #W81XWH-16-1-0466 adjudicado a R.M. Brewster. E. Vital fue apoyado por una beca a UMBC de la Howard Hughes Medical Institute a través del preuniversitario y licenciatura Ciencias Educación, grant #52008090. S.P. Brown fue apoyado por un departamento de los Estados Unidos de educación GAANN becas, una beca de postgrado de Meyerhoff financiado por subvenciones de NIH/NIGMS #GM055036 y una ayudantía de investigación financiado por el DOD de Estados Unidos grant #W81XWH-16-1-0466.
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
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