Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Summary

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca^{2 +} réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Abstract

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Réticulum sarcoplasmique cardiaque (SR) sert d’un Ca^{2 +} réservoir de contraction, qui reuptakes intracellulaire Ca^{2 +} lors du relâchement. La SR Ca^{2 +} réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque, et la suppression du Ca intracellulaire^{2 +} est critique pour la fonction cardiaque diastolique. Dans certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et l’insuffisance cardiaque, le dégagement de calcium ayant une déficience et SR Ca^{2 +} store dans les cardiomyocytes peuvent être impliqués dans la progression du dysfonctionnement cardiaque. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer SRCa^{2 +} réserve et diastolique Ca^{2 +} suppression. En bref, un cardiomyocyte unique a été isolée par voie enzymatique, et la fluorescence^{2 +} Ca intracellulaire indiquée par Fura-2 a été enregistrée par un système d’imagerie calcique. Pour utiliser une caféine pour induire la libération totale de SR Ca^{2 +} , nous prédéfinir un assorties de perfusion automatique interconnexion la stimulation et le système de perfusion. Ensuite, l’ajustement de la courbe exponentielle mono a été utilisé pour analyser les constantes de temps de désintégration des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine. En conséquence, la contribution de la SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) et Na⁺-Ca^{2 +} échangeur (NCX) à l’élimination du calcium diastolique a été évaluée.

Introduction

Calcium intracellulaire ([Ca^{2 +}]_i) recyclage joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes¹. Comme nous le savons, la calcium Ca^{2 +} libération induite initie l’excitation-contraction de couplage, qui traduisent le signal électrique à la contraction. Dépolarisation de la membrane active le sarcolemme Ca L-type canaux^{2 +} , qui induisent la Ca^{2 +} libèrent de SR dans le cytoplasme par l’intermédiaire de récepteurs de la ryanodine (RyR2) de 2. Les transitoires élevées cytoplasmique Ca^{2 +} initie la contraction des myofibrilles. Au cours de la diastole, cytoplasmique Ca^{2 +} est reuptaken dans la SR au moyen de la SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) et pompé hors du cardiomyocyte via la Na⁺-Ca^{2 +} échangeur (NCX)². Ce processus conduit à la contraction-relaxation recyclage dans le cardiomyocyte.

Le SR cardiaque est un réseau de membrane intracellulaire qui entoure la machinerie contractile. Il sert un Ca^{2 +} réservoir pour contraction et il réabsorbe intracellulaire Ca^{2 +} lors du relâchement. La SR Ca^{2 +} réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque. Pendant ce temps, la suppression du Ca intracellulaire^{2 +} est critique pour la diastole cardiaque. Sous certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et une insuffisance cardiaque, ayant une déficience Ca^{2 +} dégagement et déprimé SR Ca^{2 +} magasin dans les cardiomyocytes peut être impliqué dans le processus de la dysfonction cardiaque^{2,3 ,4}.

Pour mesurer la libération de SR Ca^{2 +} et diastolique Ca^{2 +} enlèvement dans les cardiomyocytes, il y a deux approches couramment : l’intégrité du NCX courant issu des patch clamp^5,6et l’autorité de certification induit par la caféine ^{2 +} pulse issu de^{Ca 2 +} fluorescence d’imagerie^7,8,9. La première approche repose sur le fait que le Ca^{2 +} libéré de la SR est largement pompé hors de la cellule par NCX. Toutefois, cette approche est limitée par son exigence d’équipements de pointe et l’exploitation habile. Dans la présente étude, nous décrivons une approche pratique pour évaluer le SR Ca^{2 +} réserve et Ca^{2 +} enlèvement dans les myocytes en mesurant un induit par la caféine Ca^{2 +} pulse basé sur un Ca^{2 +} fluorescence système d’imagerie. En bref, fluorescence intracellulaire de Ca^{2 +} est indiqué par Fura-2. Par interconnexion du système de perfusion et un système de stimulation, nous présentons un programme pour passer la perfusion et le rythme de système automatiquement. 10 mM de caféine a été employé pour induire rapidement la libération totale de Ca^{2 +} dans le SR. Les constantes de temps de décroissance exponentielle (Tau) des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine proviennent de la courbe exponentielle mono, qui reflètent la contribution de SERCA et NCX diastolique Ca^{2 +} retrait en conséquence.

Protocol

toutes les expérimentations animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme au centre de recherche expérimentale, Académie chinoise des Sciences médicales chinoises et Université de Zhejiang et d’institutionnels animalier. 1. préparation de la solution préparer toutes les solutions tel que décrit dans le tableau 1. 2. isolement de gauche ventricule (LV) Cardiomyocytes<…

Representative Results

Ici, nous illustrons la streptozotocine (STZ) – induced rats diabétiques (DM) et appariés selon l’âge Sprague – Dawley (SD) les rats par exemple. des rats SD mâles âgés de 8 semaines (200 ± 20 g) a reçu une injection intrapéritonéale de STZ (70 mg/kg, ip) pour le tampon de groupe ou citrate de DM pour le groupe témoin. Une semaine après l’administration de STZ, rats avec glycémie > 16,7 mmol/L ont été considérés comme diabétique. Après 8 semaines, les myocytes L…

Discussion

Le flux de calcium libéré de la SR est la Ca^{2 +} source principale pour la systole au cœur. Dans une certaine mesure, l’amplitude de la SR Ca^{2 +} contenu et fractionnaire Ca^{2 +} libéré de la SR reflètent la SR Ca^{2 +} réserve disponible pour la contraction cardiaque. En revanche, la Ca^{2 +} réserve de SR dépend de la capacité du SR Ca^{2 +} recaptage, Ca^{2 +} fuite de SR et leur équilibre dans l’ensemble de la SR au cours de la diastole<sup c…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436