Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular
Summary
El objetivo de este protocolo es describir la recolección y el procesamiento de muestras quirúrgicas humanas para múltiples aplicaciones de aguas abajo en schwannoma vestibular y la investigación con células de Schwann.
Abstract
Los schwannomas vestibulares son las neoplasias más comunes del ángulo cerebelopontino, constituyendo un 6-8% de todos los crecimientos intracraneales. Aunque estos tumores causan pérdida auditiva neurosensorial en hasta el 95% de los individuos afectados, los mecanismos moleculares subyacentes a esta pérdida auditiva siguen siendo esquivos. Este artículo describe los pasos establecidos en nuestro laboratorio para facilitar la recolección y procesamiento de varias muestras de tejido humano primario para aplicaciones de investigación en aguas abajo integrantes del estudio de schwannomas vestibulares. Específicamente, este trabajo describe un marco metodológico unificado para la recolección, procesamiento y cultivo de células de Schwann y schwannoma de muestras quirúrgicas. Esto se integra con los pasos de procesamiento paralelos ahora considerados esenciales para la investigación actual: la recolección de secreciones tumorales y nerviosas, la preservación del ARN y la extracción de proteínas de tejidos recolectados, la fijación de tejido para la preparación de secciones,D la exposición de las células humanas primarias a los virus adeno-asociados para su aplicación a la terapia génica. Además, este trabajo destaca el enfoque quirúrgico translabyrinthine para recoger este tumor como una oportunidad única para obtener epitelio sensorial humano desde el oído interno y perilymph. Se proporcionan consejos para mejorar la calidad experimental y se destacan las trampas comunes.
Introduction
Los schwannomas vestibulares (SV) son los neoplasmas más comunes del ángulo cerebelopontino, diagnosticados en 1 de cada 100.000 individuos. Aunque no metastásicos, estos tumores afectan gravemente la calidad de vida del paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los individuos afectados comúnmente viven con pérdida de audición, tinnitus, y una sensación de plenitud auditiva. Los síntomas se vuelven cada vez más debilitantes a medida que el tumor crece, causando problemas de equilibrio, parálisis facial y deterioro de otras funciones del nervio craneal. Complicaciones potencialmente mortales debido a la compresión del tronco encefálico también puede resultar 7 .
Las opciones de manejo para VS se limitan esencialmente a la espera vigilante de tumores estáticos y radioterapia estereotáctica o resección quirúrgica de tumores en crecimiento <sUp class = "xref"> 8. La extirpación quirúrgica de estos tumores en los hospitales afiliados a la investigación presenta la oportunidad de adquirir y analizar el tejido tumoral fresco recogido durante las cirugías del paciente. Una aproximación quirúrgica específica a la VS, la resección translabyrinthine, puede incluso ofrecer el acceso al epitelio sensorial humano valioso del oído interno y del perilymph.
Debido a que los VSs surgen de un nervio sensorial periférico ( es decir, el nervio vestibular), es importante comparar las observaciones asociadas con VS con las derivadas de un nervio control adecuado, como el gran nervio auricular humano (GAN). Los GAN sanos se sacrifican regularmente durante las parotidectomías o disecciones del cuello y pueden utilizarse como modelos robustos para la fisiología sana de las células de Schwann 9 .
Debido a que no hay fármacos aprobados por la FDA para el tratamiento o la prevención de VS esporádicos, es imperativo que los investigadores elucidar el mecanismo molecular subyacenteDe la enfermedad para identificar objetivos terapéuticos. Las proteínas que se ha demostrado que juegan un papel en la patogenia VS incluyen merlin, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenasa 2 (COX-2), factor nuclear kappa B (NF-κ B), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y moléculas de señalización relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Recientes avances han ampliado y mejorado los protocolos para la recolección, procesamiento, cultivo, y la investigación posterior de primaria schwannomas vestibulares humanos y tejidos nerviosos saludables [ 18 , 19] . Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes están diseñados paraDe dichos tejidos para una única solicitud de investigación posterior ( es decir, cultivo celular solo). Este artículo presenta un marco metodológico unificado para el procesamiento simultáneo de una única muestra primaria VS o GAN humana para múltiples aplicaciones aguas abajo: cultivo específico de tipo celular, extracción de proteínas, preservación de ARN, recolección de secreción tumoral y fijación de tejido. Este trabajo también detalla la colección quirúrgica y el procesamiento de líquido cefalorraquídeo humano (LCR) y perilinfa durante la resección translaviríntica VS, ya que estos tejidos estrechamente relacionados pueden servir como fuentes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo presenta pasos para la transducción viral de células VS humanas primarias en cultivo como una aplicación novedosa de este tejido para uso en terapia génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describe un marco metodológico unificado para la investigación VS, que describe el procesamiento simultáneo de especímenes humanos VS y GAN para aplicaciones de investigación aguas abajo. A medida que la investigación VS entra en la era de la medicina de precisión, la preparación de la misma muestra en formas capaces de responder a numerosas preguntas de investigación permitirá el descubrimiento de los conocimientos moleculares, celulares, genéticos y proteómicos específicos de cada paciente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo JES y SD), el Departamento de Defensa W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS) , La Fundación Nancy Sayles Day (KMS), el Lauer Tinnitus Research Center (KMS) y la Fundación Barnes (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
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