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Bio-ingénierie

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Nous présentons ici une bicouche lipidique supportée dans le contexte d'une plate-forme microfluidique pour étudier les interactions protéines-phosphoinositides en utilisant une méthode sans étiquette basée sur la modulation du pH.

Abstract

De nombreuses protéines cellulaires interagissent avec les surfaces membranaires pour affecter les processus cellulaires essentiels. Ces interactions peuvent être dirigées vers un composant lipidique spécifique dans une membrane, comme dans le cas des phosphoinositides (PIP), pour assurer une localisation et / ou une activation sous-cellulaires spécifiques. Les PIP et les domaines de liaison cellulaire PIP ont été largement étudiés pour mieux comprendre leur rôle dans la physiologie cellulaire. Nous avons appliqué un test de modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées (SLB) comme outil pour étudier les interactions protéines-PIP. Dans ces études, la phosphatidyléthanolamine conjuguée à l' ortho -Sulforhodamine B est utilisée pour détecter les interactions protéine-PIP. Lors de la liaison d'une protéine à une surface de membrane contenant du PIP, le potentiel interfacial est modulé ( c.-à-d. Le changement du pH local), en déplaçant l'état de protonation de la sonde. Une étude de cas de l'utilisation réussie du test de modulation de pH est présentée en utilisant la phospholipase C delta1 PleckstrDans le domaine de l'homologie (PLC-δ1 PH) et de l'interaction phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) à titre d'exemple. La constante de dissociation apparente ( K d, app ) pour cette interaction était de 0,39 ± 0,05 μM, similaire à K d, valeurs d' application obtenues par d'autres. Comme précédemment observé, le domaine PLC-δ1 PH est PI (4,5) P 2 spécifique, montre une liaison plus faible au phosphatidylinositol 4-phosphate et ne se lie pas aux SLB de phosphatidylcholine pure. Le dosage PIP-on-a-chip est avantageux par rapport aux essais traditionnels de liaison au PIP, y compris, mais sans s'y limiter, le faible volume de l'échantillon et les exigences d'étiquetage du ligand / récepteur, la capacité de tester des interactions membranaires à haute et faible affinité avec les petits et les petits De grandes molécules et un rapport signal / bruit amélioré. En conséquence, l'utilisation de l'approche PIP-on-a-chip facilitera l'élucidation des mécanismes d'une large gamme d'interactions membranaires. En outre, cette méthode pourrait être possibleDans l'identification des agents thérapeutiques qui modulent la capacité des protéines à interagir avec les membranes.

Introduction

De nombreuses interactions et processus biochimiques se déroulent sur des surfaces à membrane bidimensionnellement fluides. Les organites membranaires dans les cellules eucaryotes sont exclusives non seulement dans les procédés biochimiques et leur protéome associé, mais également dans leur composition lipidique. Une classe exceptionnelle de phospholipides est la phosphoinositide (PIP). Bien qu'ils ne représentent que 1% du lipidome cellulaire, ils jouent un rôle crucial dans la transduction du signal, l'autophagie et le trafic de la membrane, entre autres 1 , 2 , 3 , 4 . La phosphorylation dynamique du groupe de tête d'inositol par les PIP kinases cellulaires donne naissance à sept groupes de tête PIP mono-, bis- ou tris-phosphorylés 5 . En outre, les PIP définissent l'identité subcellulaire des membranes et servent de sites d'ancrage membranaire spécialisés pour les protéines / enzymes contenant un ou plusieurs phosphoinosItide-binding domains, par exemple, Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) et epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . L'un des domaines de liaison au PIP le mieux étudié est le domaine de phospholipase C (PLC) -δ1 PH qui interagit spécifiquement avec le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) dans une affinité de gamme micromolaire élevée à haut nanomolaire 8 , 9 , 10 , 11 .

Une variété de méthodes qualitatives et quantitatives in vitro ont été développées et utilisées pour étudier le mécanisme, la thermodynamique et la spécificité de ces interactions. Parmi les tests de liaison au PIP les plus couramment utilisés, on trouve la résonance plasmonique de surface (SPR), la calorimétrie isotherme (ITC), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), le test de flottation / sédimentation de liposomes et les transferts de lipides (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Bien que ceux-ci soient largement utilisés, ils ont tous de nombreux inconvénients. Par exemple, le SPR, l'ITC et la RMN nécessitent de grandes quantités d'échantillons, d'instruments coûteux et / ou de personnel formé 12 , 13 . Certains formats de dosage tels que des lipides à base d'anticorps utilisent des formes hydrosolubles de PIP et les présentent de manière non physiologique 12 , 14 , 15 , 16 . En outre, les transferts de lipides ne peuvent être quantifiés de manière fiable et ils ont souvent abouti à des observations fausses positives / négatives 12 , 17 , 18 . Pour surmonter ces défis et améliorer l'ensemble d'outils actuel, une nouvelle méthode sans étiquette a été établie sur la base d'une bicouche lipidique supportée (SLB) dans le contexte d'am Icrofluidic platform, qui a été appliquée avec succès à l'étude des interactions protéine-PIP ( figure 1 ) 19 .

La stratégie utilisée pour détecter les interactions protéines-PIP est basée sur la détection de la modulation du pH. Cela implique un colorant sensible au pH qui a ortho -Sulforhodamine B ( o SRB) directement conjugué au groupe 20 de tête de lipide de phosphatidyléthanolamine. La sonde o SRB-POPE (figure 2A) est hautement fluorescent à faible pH et désactivé à un pH élevé avec un pKa d' environ 6,7 à moins de 7,5% en moles de PI (4,5) P2 contenant SLBS (figure 5B). Le domaine de PLC-δ1 PH a été largement utilisé pour valider les méthodologies de liaison aux protéines-PIP en raison de sa spécificité élevée vis-à-vis de PI (4,5) P 2 ( Figure 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Par conséquent, nous avons estimé que le domaine PLC-δ1 PH peut être utilisé pour tester sa liaison à PI (4,5) P 2 à travers le test PIP-on-a-chip. La construction de domaine PH utilisé dans cette étude a une charge positive nette (pI 8,4) et attire ainsi OH -. ions (Figure 5C) Lors de la liaison de PI (4,5) P2 contenant SLBS, le domaine PH apporte les ions OH – au surface de la membrane, ce qui module le potentiel interfacial et déplace l'état de protonation de o SRB-POPE (Figure 5C) 26. en fonction de la concentration PH de domaine, la fluorescence est éteinte (Figure 6A). Enfin, les données normalisées est S'adapter à une isotherme de liaison pour déterminer l'affinité de l'interaction PH-PI (4,5) P 2 ( Figure 6B , 6C ). </ P>

Dans cette étude, un protocole détaillé est fourni pour effectuer la liaison des protéines aux SLB contenant du PIP dans une plate-forme microfluidique. Ce protocole permet au lecteur d'assembler le dispositif microfluidique et la préparation des vésicules à la formation de SLB et à la liaison des protéines. De plus, le mode d'analyse de données pour extraire des informations affinité pour le domaine de PH PI-PLC-δ1 (4,5) P 2 interaction sont fournis.

Protocol

1. Nettoyage des couvertures de verre Diluez la solution de nettoyage 7x (voir la table des matériaux ) 7 fois avec de l'eau désionisée dans un plat en verre de borosilicate de 100 mm de profondeur avec un fond plat et chauffez-le jusqu'à 95 ° C sur une plaque chauffante chaude pendant 20 minutes ou jusqu'à ce que la solution trouble devienne claire . REMARQUE: la solution sera chaude, faites attention pour éviter les blessures corporelles. La solution de nettoyage 7…

Representative Results

Nous avons utilisé le test de modulation du pH pour étudier l'interaction PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 dans un micro-dispositif PIP-on-a-chip ( Figure 1 ). Grâce à un protocole détaillé, nous avons démontré comment préparer et assembler les composants des dispositifs microfluidiques, fabriquer de petites vésicules unilamellaires (VUS) ( Figure 2 ), former des SLB dans un dispositif ( Figu…

Discussion

Chaque variante PIP, bien que faiblement concentrée, est présente sur la surface cytosolique d'organites spécifiques où elle contribue à l'établissement d'une composition physique unique et de la spécificité fonctionnelle de la membrane organellaire 1 . L'une des utilisations les plus importantes des PIP est une plate-forme d'amarrage spécifique pour la multitude de protéines nécessitant une localisation et / ou une activation sous-cellulaire spécifiques <sup class…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS et la CCE ont été soutenus, en partie, par la subvention AI053531 (NIAID, NIH); SS et PSC ont été soutenus par la subvention N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
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References

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Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
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Citer Cet Article
Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
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