Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em> In Utero</em> Elettroporazione
Summary
Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.
Abstract
Nell'utero l' elettroporazione è un approccio veloce e potente per studiare il processo di migrazione radiale nella corteccia cerebrale degli embrioni di topo di sviluppo. Ha contribuito a descrivere i diversi passi della migrazione radiale e caratterizzare i meccanismi molecolari che controllano questo processo. Per analizzare in modo diretto e dinamico i neuroni migrativi, essi devono essere rintracciati nel tempo. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che combina de elettroporazione utero con la cultura di fetta organotypica e imaging confocale a tempo intervallo, che consente un esame diretto e un'analisi dinamica dei migratori radiali di neuroni corticali. Inoltre, è possibile la caratterizzazione dettagliata dei neuroni migranti, quali velocità di migrazione, profili di velocità e cambiamenti di orientamento radiale. Il metodo può essere facilmente adattato per eseguire analisi funzionali di geni di interesse per la migrazione radiale dei neuroni corticali mediante perdita e guadagno di funzione, nonché esperimenti di salvataggio. Lasso di tempoL'imaging dei neuroni migratori è una tecnica all'avanguardia che una volta stabilita è un potente strumento per studiare lo sviluppo della corteccia cerebrale nei modelli di mouse dei disturbi della migrazione neuronale.
Introduction
Il neocortex è il principale sito di funzioni cognitive, emotive e sensoriali. È composto da sei strati orizzontali orientati in parallelo alla superficie del cervello. Durante lo sviluppo, le cellule progenitrici nella parete laterale del telencephalon dorsale danno origine a neuroni di proiezione che migrano radialmente verso la superficie del piolo e acquisiscono un'identità neuronale specifica di tipo strato. Dopo essere stati generati nelle zone ventricolari / subventricolari (VZ / SVZ) questi neuroni diventano temporaneamente multipolari e rallentano la loro migrazione. Dopo un breve periodo di permanenza nella zona intermedia (IZ) si passa alla morfologia bipolare, si collega all'impianto radiale dell'altile e continua la migrazione orientata radialmente nella piastra corticale (CP). Al raggiungimento del loro obiettivo finale di proiezione i neuroni si staccano dai processi radiali degli gliali e acquisiscono un'identità specifica del livello. Le mutazioni nei geni che colpiscono varie fasi della migrazione neuronale possono causare gravi malformazioni corticali, come lissencEfalia o eterotopia della materia bianca 1 , 2 .
Nell'utero l' elettroporazione è una tecnica rapida e potente per trasfettare le cellule progenitrici neurali nel cervello in sviluppo degli embrioni di roditore 3 , 4 . Con questa tecnica è possibile sconnessioni e / o sovrapressione di geni di interesse per studiare le loro funzioni nello sviluppo di neuroni. Questo metodo ha contribuito in modo specifico a descrivere i dettagli morfologici e caratterizzare i meccanismi molecolari del processo di migrazione radiale 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . I neuroni che migrano radicalmente subiscono variazioni dinamiche in forma cellulare, velocità di migrazione e direzione migratoria, che richiedono un'osservazione diretta e continua nel tempo. Cultu di fetta organotipicaLa riqualificazione e la temporanea imaging confocale dei cervelli elettroporati permettono di osservare direttamente i neuroni migranti nel tempo. Utilizzando questo approccio combinato, è possibile analizzare le caratteristiche distinte dei neuroni migratori che non possono essere studiati in sezioni di tessuti fissi di cervelli elettroporati.
Abbiamo recentemente applicato l'imaging confocale dei migratori neuronali in culture di fetta di cervelli elettroporati per studiare il ruolo del CLL / linfoma 11a (Bcl11a) della cellula B della trascrizione nel corso dello sviluppo corticale 10 . Bcl11a è espresso in giovani neuroni corticali migranti e abbiamo utilizzato un mutante Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 condizionato per studiare le sue funzioni. L'elettroporazione di Cre ricombinasi insieme a proteine fluorescenti verdi (GFP) nei progenitori corticali di cervelli flox / flox Bcl11a ci ha permesso di creare una situazione di mutante mosaico, in cui solo alcune cellule sono mutate in unAltrimenti sfondo di natura selvaggia. In questo modo, è stato possibile studiare le funzioni autonome delle cellule Bcl11a a livello di singola cellula. Abbiamo scoperto che i neuroni mutanti Bcl11a mostrano velocità ridotte, spostamenti nei loro profili di velocità, nonché cambiamenti di orientamento casuale durante la loro migrazione 10 . Nel protocollo descritto descriviamo un flusso di lavoro per l'elettroporazione di successo e la preparazione della coltura di fetta 12 dei cervelli del topo, nonché l'imaging confocale delle colture corticali di fetta.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migrazione radicale è un processo fondamentale nello sviluppo del neocortex. Le mutazioni in geni che influenzano diverse fasi di questo processo possono causare gravi malformazioni corticali, tra cui lissencefalia e della sostanza bianca eterotopia 1, 2. Recentemente abbiamo mostrato che Bcl11a, che si esprime nei giovani neuroni di proiezione corticale migratori, svolge un ruolo nella migrazione radiale. Abbiamo utilizzato l'imaging confocale dei migra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer per un'ottima assistenza tecnica, nonché Victor Tarabykin per discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
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