機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ
Summary
この研究は、異なる哺乳動物種の精巣組織から精製された生殖細胞集団を得るための方法の標準化を記載している。 Hoechst-33342とヨウ化プロピジウムで染色し、FACSソーティングを組み合わせた単純なプロトコールで、男性の生殖生物学の比較研究に幅広く使用されています。
Abstract
蛍光活性化細胞選別（FACS）は、哺乳類の精巣生殖細胞の豊富な集団を単離するための選択方法の1つである。現在、9個までのネズミ生殖細胞集団を高収率および高純度で識別することができます。精子形成を通してのクロマチン構造および量のユニークな変化のために、識別および精製におけるこの高分解能が可能である。これらのパターンは、Hoechst-33342（Hoechst）のような蛍光DNA結合色素で染色した雄生殖細胞のフローサイトメトリーによって捕捉することができる。ここには、哺乳類精巣生殖細胞を単離するために最近開発されたプロトコルの詳細な説明がある。簡単に述べると、単一細胞懸濁液は、機械的解離によって精巣組織から生成され、Hoechstおよびヨウ化プロピジウム（PI）で二重染色され、フローサイトメトリーによって処理される。異なるDNA含有量（Hoechst強度）を有する生存細胞（PI陰性）の選択を含む連続ゲーティング戦略、iFACSソーティング中に5つの生殖細胞型を区別するために使用される。精子細胞（66％）、原発性（71％）および二次性（85％）の精母細胞および精子細胞（90％）を含み、さらに円形（93％）および伸長性（87％）の亜集団に分類された。ワークフロー全体の実行は簡単で、4つの細胞タイプを適切なFACSマシンで同時に分離することができ、2時間未満で実行できます。 エキソビボ細胞の生理学を保存するためには処理時間の短縮が重要であるため、この方法は雄性生殖細胞生物学の下流ハイスループット研究には理想的です。さらに、哺乳類の生殖細胞の多種の精製のための標準化されたプロトコルは、方法論的な変数の源を排除し、単一のセットの試薬を異なる動物モデルに使用することを可能にする。
Introduction
精子形成の進行を示すin vitro系の欠如および精巣における大きな細胞異種性の存在を考慮すると、雄性生殖細胞生物学の研究は、特定の細胞型の豊富な集団を単離するための堅牢な技術を必要とする。蛍光活性化細胞選別（FACS）が広く、高い収率および純度を提供するように、この目的の1、2、3、4、5のために使用され、それは識別することができ生殖細胞型の数の他の単離方法を上回るされています6、7、8を選択します。フローサイトメトリー分析の原理は、単一細胞のレーザービーム励起後の異なる光パターンの検出に基づく。細胞がレーザーを通過すると、光を反射/散乱させる細胞の大きさ（前方散乱; FSC）および細胞内の複雑さ（側方散乱; SSC）に比例するあらゆる角度で、フローサイトメトリーの詳細については、Ormerod 9を参照してください。
雄性生殖細胞は、精子形成の異なる段階を通じてDNA含量、染色質構造、サイズおよび形状に特異的な修飾を受ける。従って、異なる細胞集団を同定し、蛍光色素10、11と光散乱とDNA染色を組み合わせることにより分離することができます。いくつかの色素は、ヘキスト33342（ヘキスト）しばしば、過去十年間1ため精巣細胞のフローサイトメトリー分析に使用される2、4、10れているように、（Geisingerとロドリゲス-Casuriaga 3に概説）は、この目的のために使用することができます、 12 。ウポUV光を有するN個の励起遠赤色蛍光は、クロマチン構造及びコンパクション1、13、14の変動を反映しているのに対し、ヘキストは、細胞のDNA含有量に比例した青色の蛍光を発します。その結果、分化の異なる段階における雄性生殖細胞は、ヘキスト染色単一細胞懸濁液のFACS中に特定のパターンを示す（HO-FACS; 1、12）。興味深いことに、精子による段階の間のみ有効である染料流出の機構に、ヘキスト青色蛍光の強度は、これらの細胞におけるクロマチン含有量に比例しないが、それらはホ- FACS 15時側集団としてクラスタ。また、非浸透性色素ヨウ化プロピジウム（PI）でヘキスト染色を組み合わせ、ユーザーがFACS 1中に死んだ（PI陽性）細胞から（PI陰性）ライブ区別することを可能にします<SUP>、2、10、12。以前にフローサイトメトリーに使用されています。この戦略は、精巣生殖細胞の分析および減数分裂I 1、2、4、16の4つの異なる段階における細胞を含む9生殖細胞型まで区別するために、マウスで広く最適化。この研究の目的のために、Hoechst染色は3つの主な利点を有する。まず、ホー-FACSは、正常マウスモデル1、2、12に雄性生殖細胞、及びそのようなラットおよびモルモット17、18、19のような他のげっ歯類の単離に適用されています。第二に、Hoechstは細胞浸透性色素であり、膜の透過性を必要としないため、vesセルの完全性。ヘキストは、（D [AT]）RNAは保存され、DNAおよびタンパク質に加えて、胚のさらに下流分子の研究に使用することができることを意味するDNA配列1、20、ポリ優先的に結合するので、最終的に、何のRNase処理を必要としません細胞分化。
哺乳動物種（GeisingerおよびRodriguez-Casuriaga 3で概説）のフローサイトメトリー分析で観察されたDNA倍数性および/または染色性の類似性にもかかわらず、フローサイトメトリーによる雄性生殖細胞単離について記載されたプロトコールにはかなりの可変性があった。異なる研究では、組織解離のための特定のプロトコールが用いられ、異なるモデル生物（主にマウス、ラットおよびモルモット）における異なるDNA結合色素（単独または組み合わせ）およびFACSゲーティング戦略が用いられている。したがって、異なる種について収集されたデータの直接の比較は、方法論間のバラツキから生ずる未成熟の技術的成果物。重要なことに、哺乳類の精子形成（2N-4N-2N-1N）におけるクロマチン動態の顕著な保存は、標準化されたプロトコールが様々な哺乳動物種に横方向に適用できることを示唆している。
本研究の目的は、以前に発表された技術2、20を組み合わせて適応させることによって、異なる哺乳動物種に適用可能であり、単一のワークフローを開発することでした。組織処理のための方法の標準化は、酵素消化に必要な種特異的調節の必要性を克服するために機械的解離を行うことによって達成された5 。齧歯類精巣組織の機械的解離は、酵素消化組織20との両方の方法のexhibによって生成された単一細胞懸濁液のホー-FACSよりも良好に機能することが示されたことは注目に値しますそれに匹敵する結果5 。原則の証明として、このプロトコールは、5つの生殖細胞集団を分離するために用いられる設定を記載する：精原細胞（SPG）; （SPC I）および二次精母細胞（SPC II）、および精子（SPD） – ラウンド（rSPD）および伸長（eSPD）を含む。重要なことは、組織解離システムとUVレーザーを備えたセルソーターへのアクセスが主な要件であり、ラボでの実装が容易であることです。このワークフロー（ 図1 ）は迅速かつ簡単で、2時間以内に新鮮な精巣組織から4つの生殖細胞集団を同時に分離することができます。減少した処理時間は、さらなる下流手順のために細胞の完全性を維持するために重要である。さらに、5種の異なる種におけるその成功した性能は、それが哺乳類のクレード内に広く適用され得ることを示唆し、哺乳動物の雄性生殖生物の比較研究のための生殖細胞を単離するための理想的な方法であるおやすみ。
このプロトコルは、（1）精巣組織の機械的解離、および（2）HoechstおよびPIによる精巣細胞の染色、（3）関連する精子形成細胞のFACS選別からなる3つの主要セクションから構成される。一旦集められると、様々な哺乳動物精巣生殖細胞のこれらの豊富な集団は、広範囲の用途に使用することができる。このプロトコルは、多くの異なる哺乳動物種からの雄性生殖細胞を精製するための「ワンサイズ適合」解離方法を記載している。単離された生殖細胞で行うことを希望する研究のタイプに応じて、他の培地または緩衝液を使用することができる。以下のプロトコールステップは、1つの全マウス精巣から単細胞懸濁液を生成するためのものである。
Protocol
Representative Results
Discussion
哺乳動物の精子形成過程における高度に保存されたクロマチン動態を考慮して、この研究の目的は、異なる哺乳動物精巣組織からの分化の異なる段階で雄性生殖細胞を単離するためのプロトコールを開発することであった（ 図1 ）。異なる動物モデルへの単一のワークフローの適用における主な障害の1つは、特に組織解離プロトコルに関して、種特異的調整の必要性で…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、犬の精巣のためのヒルサイド動物病院（ミズーリ州セントルイス）に感謝する。 Jason ArandとDr. Ted Ciceroのワシントン大学（セントルイス）で、ラット精巣とBrianne Tabersを提供してくれました。モルモット精巣のためのWashUのJared HartsockとDr. Salt's Lab;小型ブタ精巣のためのWashUの比較医学部門のマイケル・タルコット博士。著者らはまた、職員による細胞選別サービスを提供するSiteman Flow Cytometry Coreの使用について、米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部およびバーンズ – ユダヤ人病院のAlvin J. Siteman Cancer Centerに感謝しています。サイトマン癌センターは、NCI Cancer Center Support Grant＃P30 CA91842の一部でサポートされています。
この研究は、米国国立衛生研究所からの助成金[R01HD078641およびR01MH101810からDへ]のFCT博士論文[SFRH / BD / 51695/2011]FC]およびFCT研究契約[IF / 01262/2014 to AML]
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
