Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.
Menselijke hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn gevestigd in het beenmerg (BM) niche, een ingewikkeld multifactorisch netwerk van componenten die cytokines produceren, groeifactoren en extracellulaire matrix. Het vermogen van HSCs om stil te blijven, zelfherzien of te differentiëren, mutaties te verwerven en kwaadaardig te worden, hangt af van de complexe interacties die ze met verschillende stromale componenten vestigen. Om de kruispunten tussen menselijke HSC's en de menselijke BM-niche in fysiologische en pathologische condities te waarnemen, hebben we een protocol ontworpen om ectopisch model en beeld een geanimeerde BM niche in immunodeficiënte muizen te maken. We tonen aan dat het gebruik van verschillende cellulaire componenten de vorming van menselijke structuren mogelijk maakt en de mogelijkheid biedt om langdurig humaan hematopoietische engraftment te behouden. Met behulp van twee-foton microscopie kunnen we deze structuren in situ bij de single-cellresolutie imiteren, waardoor een krachtig nieuw instrument voor de functionele karakterisering van de menselijke BM mMicro-omgeving en zijn rol bij het reguleren van normale en kwaadaardige hematopoiesis.
Cel-beslissingen die in stamcelcompartimenten worden waargenomen, worden streng geregeld door zowel intrinsieke als extrinsieke factoren. In het bijzonder wordt nu algemeen erkend dat de BM micro-omgeving een fundamentele rol speelt bij het beheersen van de schakelaar in HSC's van een rustige naar een actieve toestand, evenals in hun zelfvernieuwing of differentiatieleerbeslissing 1 . Bovendien blijkt uit recente bevindingen dat hematologische kwaadaardigheden de functie van de BM micro-omgeving beïnvloeden, wat wijst op het bestaan van actieve kruisvorming tussen de twee compartimenten 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Ondanks recente vooruitgang blijven veel sleutelvragen over hoe de activiteit van specifieke BM-niche-componenten bijdraagt aan HSC-gedrag en maligne transformatie.
De BM micro-omgeving is een zeer heterogeen Eenige en complexe mix van veel verschillende celtypes, elk met gespecialiseerde functies. De overvloedige endotheliale (EC) en vasculaire component regelen de omzet van het nutriënten- en metaboliet, de ingreep en uitkomst van verschillende cellen naar en van de BM, en diverse HSC-functies 7 , 8 . Mesenchymale stromale cellen (MSC's), een heterogene populatie van ongedifferentieerde stamcellen en voorlopers verricht via drie lijnen (dwz osteogene, chondrogene een adipogene), zijn een fundamenteel onderdeel van de BM niche. Deze MSC's lokaliseren zich zowel in de centrale gebieden van de BM en in de nabijheid van het endostale gebied. Zij kunnen worden geassocieerd met vasculaire structuren en zijn betrokken bij de regulering van HSC functie 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .
Veel rapporten suggereren dat HSCs op verschillende gedefinieerde plaatsen binnen de merg verblijven en dat hun functie kan afhangen van hun precieze lokalisatie. De meeste huidige kennis over HSC's en hun interactie met de BM micro-omgeving komen uit muizenstudies 1 . Het gebruik van xenograftmodellen heeft deze kennis uitgebreid naar menselijke normale en kwaadaardige HSCs, ingrijpen in de muizen BM van immunodeficiënte muizen 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Hoewel dit een geldig model vertegenwoordigt, bevat het nog steeds vele uitdagingen, zoals de noodzaak om de ontvanger muis in de meeste gevallen voorwaarde te geven voor menselijke HSC homing en engraftment of de cross-species barrière en zijn slecht begrepen invloed op cel-cel interacties en functies.
Het gebruik van neutraliserende antilichamen en genetisch gemodificeerde muizen, samen met xenotransplantatie, heeft bijgedragen aan het complexe dialoog dat menselijke HSC's met hun micro-omgevingen vestigen. De introductie en ontwikkeling van intravitale twee-foton confocale microscopie heeft deze studies een stap vooruit gezet, waardoor de directe, hoge resolutie en dynamische beeldvorming van het beenmerg 19 , 20 , 21 , 22 mogelijk is en een krachtig instrument voor de functionele Karakterisering van de BM micro-omgeving en zijn rol bij het reguleren van de HSC-functie. Om sommige van de problemen die zich voordoen bij klassieke xenotransplantatiemodellen te omzeilen, is het concept engineering een humanized BM structuur op de voorgrond gebracht. Samenvoegen van biomaterialen en cellimplantatieconcepten, rapporten hebben aangetoond dat de haalbaarheid van het menselijk botmPijl-micro-omgeving in heterotopische gebieden 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dit maakt de mogelijkheid om bioengineering in muismodellen te gebruiken om menselijke normale en kwaadaardige hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese en metastase 40 , 41 , 42 te bestuderen . , 43 , 44 .
Gebaseerd op eerdere ervaring in botweefseltechniek en in vivo beeldvorming 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beschrijven we een protocol voor bioengineer en organische biologische humane BM-weefsels. Deze structuren zijn afkomstig van de implantatie van humane BM-afgeleide stromacellen in collageen gebaseerde steigers subcutaan ingeënt in immunodeficiënte muizen. In een eerdere rapportage hebben we aangetoond dat menselijke MSC's de vorming van een menselijke micro-omgeving waarborgen voor de inplanting van humane hematopoietische cellen 45 . Verder beschrijven we hoe de co-implantatie van een ander menselijk BM-celcomponentS, zoals menselijke endotheelcellen (hEC) en / of cytokines die belangrijk zijn voor botvorming ( bijv. HBMP2), werken samen met hMSCs om verschillende gehumaniseerde micro-omgevingen te genereren, die in situ live-imaged kunnen worden.
Betekenis met betrekking tot bestaande methoden:
In dit protocol beschreef we een methode om verschillende gehumaniseerde microomgevingen in muizen te genereren en hun architectuur te visualiseren via twee-foton microscopie en histologie. De verstrekte representatieve gegevens tonen de haalbaarheid van de aanpak aan, met behulp van verschillende stromacellen om geanimeerde weefsels te manipuleren. Het protocol heeft specifieke toepassingen op de studie van humane hematopoietische cellen en nicotine-afkomstig van beenmerg in normale en pathologische omstandigheden. Deze toepassingen omvatten de studie van klonale evolutie, drugscreening en kruisvorming tussen menselijke HSC's en stromale componenten. In het opkomende gebied van weefseltechniek zijn verschillende alternatieve benaderingen voorgesteld. Benaderingen omvatten de ontwikkeling van 3D humanized BM structuren in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 en het orthotopische transplantaat van gehumaniseerde BM-steigers in muizen 64 . Onze aanpak heeft het voordeel om zowel de complexiteit van het in vivo systeem te combineren met de makkelijke anatomische toegankelijkheid van het gehumaniseerde weefseltransplantaat.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Een bron van variabiliteit in dit protocol kan worden gevonden in de selectie van cellen die gebruikt worden om de steigers te zaaien. In ons werk hebben we BM-afgeleide hMSC's gebruikt. Mesenchymale cellen kunnen echter worden verkregen uit verschillende weefsels, die onderscheidende eigenschappen kunnen tonen afhankelijk van de oorsprong. Daarom kan het gebruik van hMSC's afgeleid van verschillende organen overwogen worden. Echter, hun vermogen om botweefsel in vivo te vormen moet worden getest voor gebruik in deze pRotocol. Dit protocol gebruikt een commercieel beschikbare menselijke endotheelcelbron ( dwz E4ORF1-getransduceerde HUVEC). Onlangs is het gebruik van orgaanspecifieke endotheelcellen voor verschillende doeleinden gerapporteerd 65 , 66 . Bovendien kan het gebruik van primaire hEC's afgeleid van de BM een interessante verbetering voor het protocol vertegenwoordigen. Daarom kan het gebruik van verschillende bronnen van endotheelcellen verschillende in vivo uitkomsten produceren.
We hebben NSG-immunocompromised recipient muizen gebruikt om de implantatie van gehumaniseerde steigers te bevorderen en weefselafwijzing te vermijden. Wij uitsluiten niet de mogelijkheid om dit protocol te gebruiken om ectopische beenmergweefsels te manipuleren in andere muisstammen. Inderdaad kan rhBMP-2 botvorming in verschillende zoogdiermodellen 47 , 48 , 49 , 50 induceren <sup>, 52 . Echter, verschillen in cellevendabiliteit en langetermijntransplantatie zullen waarschijnlijk worden waargenomen met behulp van verschillende stammen / modellen.
De timing van het herstel van de steiger kan ook flexibel zijn, afhankelijk van het uiteindelijke doel van het experiment. In het gepresenteerde protocol herstellen we de monsters op 8-12 weken na implantatie om de langdurige hematopoietische ingreep te beoordelen. Om vroege stappen van de menselijke BM nicheformatie te bestuderen ( bijv. Osteochondrale weefselvorming 47 of vaatontwikkeling), kunnen verschillende tijdspunten worden gekozen.
De live-imaging techniek die we beschreven in dit protocol zijn aangegeven voor korte termijn beeldvorming van explants. Het gebruik van een evenwichtige kamer voor het behoud van fysiologische temperatuur, zuurstofspanning en CO 2 concentratie dient in aanmerking te worden genomen bij langdurige beeldvorming, zoals het bestuderen van motiliteitsgedrag.
Critical StEps in het protocol:
Onder de uitdagingen die verband houden met het protocol, wijzen we op de technische vaardigheden die nodig zijn voor een aantal stappen. Mesenchymale en endotheelcellen dienen gebruikt te worden bij cijfers met lage celpassages; anders is, zullen ze niet in staat zijn om de menselijke hematopoietische cellen engraftment te ondersteunen in vivo of deel te nemen aan de novo vaatstelsel en botvorming in vivo. Wij raden aan het gebruik van hMSC's en hEC's in de passages 1 – 5. Voorbereiding van de steiger en de zaadcellen hebben basiscellencultuurvaardigheden en kennis van de eigenschappen van de specifieke cellen die in de procedure worden gebruikt. Het operatieprotocol is vrij eenvoudig maar vereist een beetje oefening. Onderhoud van een aseptische omgeving om verontreiniging van de geïmplanteerde steigers in immunodeficiënte muizen te vermijden is cruciaal om het succes van het experiment te waarborgen. Voorbeeld explant en live imaging vereisen chirurgische praktijk (vooral voor het gebruik van de microdrill) en kennis van deMicroscoop systeem. Tenslotte vereisen steekproefverwerking en histologie basiskennis van de te gebruiken technieken.
Beperkingen van de techniek:
De aanpak die we beschrijven maakt het mogelijk visualisatie van levende humane hematopoietische cellen die een gehumaniseerd beenmergmilieuomgeving bevinden, waarbij menselijke endotheelcellen die vasculaire structuren vormen en mesenchymale cellen vormen bot- / beenmergruimte. Aangezien het weefsel in vivo wordt gevormd, zal de uiteindelijke constructie nog steeds chimère zijn (menselijk en muizen). Dit probleem moet in aanmerking worden genomen, omdat het chimere weefsel de complexiteit en het milieu van menselijk beenmerg niet volledig kan nabootsen.
De geïmplanteerde steigers hebben een beperkte grootte (we hebben een maximum van 6,6 x 7,5 x 7 mm geprobeerd) en kunnen daarom een beperkt aantal cellen voor xenotransplantatie hosten. Het absolute aantal herstelde cellen zal ook beperkt zijn; Dus moet het aantal geïmplanteerde steigersBerekend als een functie van het aantal cellen dat nodig is voor het experiment.
De afbeeldingsapplicatie die we hebben beschreven is bijzonder nuttig voor het observeren van grote gebieden levend weefsel op dieptes van 150-200 μm van het oppervlak zonder de architectuur te beschadigen en de cellen te beschadigen. Daarom staat het niet voor de visualisatie van de gehele steiger mogelijk. Als een volledige scan van het weefsel nodig is, zouden standaard immunofluorescentiebenaderingen meer geschikt zijn.
Toekomstige Toepassingen:
De toekomstige richting van dit bioengineered model zou zijn om de complexiteit van de menselijke componenten in het weefsel te verhogen. De kennis en karakterisering van de menselijke BM niche is in de afgelopen jaren gevorderd 67 en het beschreven protocol kan een interessant platform zijn om de functie van deze nieuwe cellulaire componenten en oplosbare factoren te bestuderen, evenals hun rol bij het ondersteunen van normale / maligneMier HSCs.
Bovendien biedt de beeldvormingstechniek het potentieel voor intravitale beeldvorming van de steigers in longitudinale studies, die technische verbeteringen vereisen bij het imago van de steigers in levende, verdoofde muizen, met herstel na de operatie. Deze aanpak zou aanvullende stappen vereisen en is momenteel onderzocht in het laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Wij bedanken het personeel in de kernfaciliteiten bij het Francis Crick Institute (Biologische Onderzoeksfaciliteit, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) en Yolanda Saavedra-Torres en Mercedes Sanchez-Garzon, de dierenartsen bij Crick en LRI, voor hun waardevolle hulp. Wij zijn dankbaar voor Dr. W. Gray voor het kritisch lezen van het manuscript. DP werd ondersteund door een non-clinical research fellowship van de EHA. Dit werk werd ondersteund door The Francis Crick Institute, dat haar kernfinanciering ontvangt van Cancer Research UK (FC001045), de UK Medical Research Council (FC001045) en de Welcome Trust (FC001045).
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |