急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定
Summary
折りたたみと結合差動スキャン熱量測定による不耐熱配位子との相互作用は生体分子の迅速な評価のためのプロトコルを提案します。
Abstract
示差走査熱量測定 (DSC) は生体分子の折りたたみと結合の相互作用を支配する熱力学的パラメーターを定量化するための強力な手法です。この情報は、新しい医薬化合物のデザインに重要です。ただし、多くの医薬関連配位子 DSC 分析で使用される高温で化学的に安定はありません。したがって、熱量計セル内配位子と熱変換製品の濃度は常に変化のために結合相互作用を測定が困難します。ここでは、急速に折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的情報に変換プロセスを得るため不耐熱配位子と DSC を使用してプロトコルを提案します。我々 は MN4 不耐熱リガンド コカインに結合する DNA アプタマーを私たちの手法を適用しました。不耐熱リガンド変換の新しいグローバル フィット分析を使用すると、折りたたみとバインディング パラメーターの完全なセットは、DSC 実験のペアから取得されます。さらに、1 つだけ補足 DSC データセットと不耐熱リガンド変換の速度定数がられる場合があるを示す.生体分子、折り畳み式の低速、低速のバインディング、および不耐熱リガンドの急速な枯渇の不可逆的な集計を含むを特定およびいくつかのより複雑なシナリオのデータを分析するためのガイドラインが掲載されています。
Introduction
示差走査熱量測定 (DSC)、生体分子結合のケイ光と折り畳み式の相互作用1,2,3の強力な方法です。DSC の強みには、バインドとフォールディング機構を明らかにし、対応する熱力学的パラメーター2,3を生成する能力が含まれます。また、DSC は近く生理条件下でのソリューションで実行することができます、生体分子や配位子、例えばフルオロ、スピン ラベルまたは核同位元素4とラベルを必要としません。楽器スキャン温度、配位子の有無で、生体分子を変性するに必要な熱の量を測定します。結果サーモグラムを使用してプロセスを折り配位子を支配する熱力学的パラメーターを抽出します。DSC や他の熱力学的手法によって提供される情報は、ターゲット生体分子1,5,6,7,8医薬品の設計を指導に不可欠です。ただし、高温に繰返しスキャン (〜 60-100 ° C) 問題が発生することができます。たとえば、多くの調剤上重要な化合物を受ける転位又は高温9,10,11,すなわちへの持続的な露出に分解、不耐熱。DSC による相互作用を通常結合の検討は、熱力学的解析12サーモグラムの再現性を確認するために複数の前方および逆のスキャンを必要とします。初期配位子の変更の結合特性を持つセカンダリ形式への変換熱が初期のリガンドの濃度低下しながら各スキャン形状と連続サーモグラムの位置で顕著な違いにつながる、熱変換製品を蓄積します。これらのデータセットは、伝統的な解析に適しておりません。
我々 は最近不耐熱リガンド DSC データセットの生体分子の折りたたみを支配する、バインドに参照される単一のリガンド結合実験からの相互作用の熱力学的パラメーターの完全なセットを生成するグローバル継ぎ手方式を開発した、無料生体分子4の必要なサーモグラムは。分析低減実験時間とサンプルに必要な 〜 10 倍標準的な DSC 手法に比べて。占めているサーモグラムはリガンドの濃度に依存しない各スキャンの高温部分の間に配位子のこれを仮定することにより熱の変換が行われます。したがって、配位子濃度は熱力学的パラメーターを抽出するために使用するサーモグラムの部分内にある定数です。私たちはさらに高温平衡期間が長く 1 つの補足実験を実行することによって配位子の熱変換の速度定数の取得方法を示した。配位子の温度差が少ない温度依存性システム (すなわち、すべての温度でかなり発生している)、分析は変数リガンド濃度を含めるように変更することができます。ここで我々 は急速に高温で benzoylecgonine に変換する不耐熱リガンド コカインの存在下で DNA アプタマー MN4 手順をデモンストレーション (> 60 の ° C)。これらの実験の温度で変換が行われない MN4 と連結されますので、キニーネはリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されます。不耐熱リガンド DSC データセットと降伏の折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的パラメーター変換プロセス解析の買収について述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
変更とトラブルシューティング
図 1 と図 2で使用されているグローバル フィット分析の詳細がされている4で説明しました。ここでは、実行して不耐熱配位子を DSC 結合実験の分析の実用的な側面をまとめました。不耐熱配位子だけでは配位子から差し引かれるために、DSC ベースラインが得られる?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V は、マギル大学自然科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) Bionanomachines トレーニング プログラムによって支えられました。A. K. M. と p. e. j. は、レベル補助金 327028-09 (A. K. M) と 238562 (p. e. j.) によって支えられました。
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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