मापने Thermolabile लाइगैंडों के साथ आणविक डीएससी प्रोफाइल तेजी से तह और बाध्यकारी बातचीत की विशेषता के लिए
Summary
हम thermolabile लाइगैंडों के साथ एक आणविक तह और बाध्यकारी बातचीत के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत अंतर स्कैनिंग calorimetry का उपयोग कर ।
Abstract
अवकलन स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) एक शक्तिशाली तकनीक है जो कि आणविक तह और बाध्यकारी इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाले ऊष्मा मापदंडों को बढ़ाता है । यह जानकारी नई दवा यौगिकों के डिजाइन में महत्वपूर्ण है । हालांकि, डीएससी विश्लेषणों में प्रयुक्त उच्च तापमान पर कई भेषज प्रासंगिक लाइगैंडों रासायनिक रूप से अस्थिर हैं । इस प्रकार, बाध्यकारी बातचीत को मापने चुनौतीपूर्ण है क्योंकि लाइगैंडों और थर्मल में परिवर्तित उत्पादों की सांद्रता लगातार कैलोरीमीटर कोशिका के भीतर बदल रहे हैं । यहां, हम तेजी से तह, बाध्यकारी, और ligand रूपांतरण प्रक्रियाओं पर ऊष्मा और काइनेटिक जानकारी प्राप्त करने के लिए thermolabile लाइगैंडों और DSC का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम डीएनए aptamer MN4 है कि thermolabile ligand कोकीन को बांधने के लिए हमारे विधि लागू किया है । एक नई वैश्विक फिटिंग विश्लेषण है कि thermolabile ligand रूपांतरण के लिए खातों का उपयोग करना, तह और बाध्यकारी मापदंडों का पूरा सेट DSC प्रयोगों की एक जोड़ी से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, हम बताते हैं कि thermolabile ligand रूपांतरण के लिए दर स्थिरांक केवल एक अनुपूरक डीएससी डेटासेट के साथ प्राप्त किया जा सकता है । कई जटिल परिदृश्यों से डेटा की पहचान करने और उनका विश्लेषण करने के लिए दिशानिर्देश प्रस्तुत किए जाते हैं, जिनमें thermolabile ligand का अपरिवर्तनीय एकीकरण, धीमे तह, धीमी बाइंडिंग और तीव्र गति से कमी शामिल है ।
Introduction
अवकलन स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) quantitating आणविक बाइंडिंग और तह इंटरैक्शन1,2,3के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । DSC की शक्तियों को बाध्यकारी और तह तंत्र स्पष्ट करने की क्षमता शामिल है, और इसी ऊष्मा मापदंडों2,3उपज । इसके अलावा, DSC निकट शारीरिक स्थितियों के तहत समाधान में प्रदर्शन किया जा सकता है और fluorophores, स्पिन-लेबल या परमाणु आइसोटोप4के साथ, उदा, ligand के लेबल की आवश्यकता नहीं है । साधन तापमान में स्कैन करता है, की उपस्थिति और ligand की अनुपस्थिति में इस अणु को विकृत करने के लिए आवश्यक गर्मी की मात्रा को मापने. परिणामस्वरूप thermograms ligand बाध्यकारी और तह प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए ऊष्मा मापदंडों को निकालने के लिए उपयोग किया जाता है । DSC या अंय ऊष्मा तकनीकों द्वारा प्रदान की गई जानकारी1,5,6,7,8अणुओं को लक्षित दवाओं के डिजाइन मार्गदर्शक के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, उच्च तापमान (~ ६०-१०० डिग्री सेल्सियस) करने के लिए दोहराया स्कैनिंग समस्याग्रस्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कई फार्मास्यूटिकल्स महत्वपूर्ण यौगिकों उच्च तापमान9,10,11, यानीके लिए निरंतर प्रदर्शन पर पुनर्व्यवस्था या अपघटन से गुजरना, वे thermolabile हैं । DSC द्वारा बंधन बातचीत की परीक्षा आमतौर पर कई आगे और रिवर्स स्कैन की आवश्यकता है क्रम में ऊष्मा के विश्लेषण के लिए thermogram के reproducibility को सत्यापित करने के लिए12। बदल बाइंडिंग विशेषताओं के साथ एक माध्यमिक फार्म के लिए एक प्रारंभिक ligand के थर्मल रूपांतरण आकार और क्रमिक thermograms की स्थिति में स्पष्ट मतभेद की ओर जाता है, प्रारंभिक ligand की एकाग्रता के बाद से प्रत्येक स्कैन के साथ कम हो जाती है, जबकि थर्मल रूपांतरण उत्पादों जमा । ये डेटासेट पारंपरिक विश्लेषणों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं.
हमने हाल ही में thermolabile ligand डीएससी डेटासेट के लिए एक वैश्विक फिटिंग पद्धति विकसित की है जो कि एक एकल ligand-बाउंड प्रयोग से संदर्भित, गैर-आणविक तह और बाध्यकारी इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाली ऊष्मा मापदंडों का पूरा सेट पैदावार नि: शुल्क4अणु के लिए अपेक्षित thermogram । विश्लेषण प्रयोगात्मक समय और ~ 10 गुना मानक डीएससी दृष्टिकोण की तुलना में आवश्यक नमूना कम कर देता है । हम मानते हुए यह एक स्कैन के उच्च तापमान भाग जहां thermogram ligand एकाग्रता पर निर्भर नहीं करता है के दौरान होता है द्वारा ligand थर्मल रूपांतरण के लिए हिसाब है । इसलिए, ligand एकाग्रता ऊष्मा मापदंडों को निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है कि thermogram के हिस्से के भीतर एक स्थिर है । हम इसके अतिरिक्त प्रदर्शन कैसे ligand थर्मल रूपांतरण के लिए लगातार दर एक लंबे समय तक उच्च तापमान equilibration अवधि के साथ एक अनुपूरक प्रयोग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । सिस्टम के लिए जहां ligand थर्मल रूपांतरण कम तापमान निर्भर है (यानी, सभी तापमान पर होने वाली appreciably), विश्लेषण चर ligand सांद्रता शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यहां हम thermolabile ligand कोकीन, जो तेजी से उच्च तापमान पर benzoylecgonine में धर्मांतरित (> 60 डिग्री सेल्सियस) की उपस्थिति में डीएनए aptamer MN4 के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन । कुनैन ligand thermolability के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह इन प्रयोगात्मक तापमान पर रूपांतरण से गुजरना नहीं करता है और भी MN4 को बांधता है । हम thermolabile ligand डीएससी डेटासेट के अधिग्रहण और उनके विश्लेषण के तह, बाध्यकारी और ligand रूपांतरण प्रक्रियाओं की ऊष्मा और काइनेटिक मापदंडों का वर्णन करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
संशोधन और समस्या निवारण
चित्रा 1 और चित्रा 2 में इस्तेमाल किया वैश्विक फिटिंग विश्लेषण का ब्यौरा पहले से4बताया गया है. यहां, हम प्रदर्शन और thermolabile लाइगैंडो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आर. डब्ल्यू. एच. वी. मैकगिल नेचुरल साइंसेज और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (NSERC) Bionanomachines में प्रशिक्षण कार्यक्रम का समर्थन किया था. ए. के. एम. और पी. ई. जे. NSERC अनुदान 327028-09 (ए. के. एम.) और २३८५६२ (पी. ई. जे.) द्वारा समर्थित थे.
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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