Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações
Summary
Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.
Abstract
Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é uma técnica poderosa para quantificação dos parâmetros termodinâmicos que regem biomolecular de dobramento e interações de ligação. Esta informação é fundamental na concepção de novos compostos farmacêuticos. No entanto, muitos ligantes farmaceuticamente relevantes são quimicamente instáveis a temperaturas elevadas, usado em análises de DSC. Assim, as interações de ligação de medição é um desafio porque as concentrações de ligantes e termicamente-convertido produtos estão constantemente mudando dentro da célula do calorímetro. Aqui, apresentamos um protocolo usando ligantes termolábeis e DSC para rapidamente obter informação termodinâmica e cinética sobre o dobramento, a vinculação e ligante processos de conversão. Nós aplicamos nosso método para aptamer o DNA MN4 que vincula a cocaína de ligante termolábil. Usando uma nova análise de encaixe global que é responsável para a conversão de ligante termolábeis, o conjunto completo de dobramento e parâmetros de ligação são obtidos a partir de um par de experimentos de DSC. Além disso, mostramos que a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis pode ser obtida com apenas um conjunto de dados suplementar DSC. As orientações para a identificação e análise de dados de vários cenários mais complicados são apresentadas, incluindo agregação irreversível da biomolécula, dobramento lento, ligação lenta e rápido esgotamento do ligante termolábil.
Introduction
Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é um método poderoso para dosar biomolecular vinculação e dobramento interações1,2,3. Os pontos fortes do DSC incluem sua habilidade de elucidar de ligação e mecanismos de dobramento e para produzir os correspondentes parâmetros termodinâmicos2,3. Além disso, o DSC pode ser executada em solução sob condições fisiológicas perto e não exige a rotulagem da biomolécula ou ligante, por exemplo, com fluorophores, rotação-etiquetas ou isótopos nucleares4. O instrumento scans na temperatura, medir a quantidade de calor necessária para desnaturar a biomolécula na presença e na ausência de ligante. As termogramas resultantes são usadas para extrair os parâmetros termodinâmicos que regem o ligante de ligação e de processos de dobramento. As informações fornecidas pelo DSC ou outras técnicas termodinâmicas são fundamentais para guiar o projeto das drogas segmentação biomoléculas1,5,6,7,8. No entanto, a digitalização repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) pode ser problemático. Por exemplo, muitos compostos farmaceuticamente importantes sofrem rearranjo ou decomposição após a exposição prolongada a altas temperaturas9,10,11, ou seja,eles são termolábeis. Análise de ligação interações por DSC normalmente exige várias digitalizações de frente e verso a fim de verificar a reprodutibilidade da termograma para análises termodinâmicas12. Conversão térmica de um ligante inicial em uma forma secundária com características alteradas vinculação conduz a pronuncia-se diferenças na forma e posição de termogramas sucessivas, desde que a concentração do ligante inicial diminui com cada verificação enquanto o produtos de conversão térmica se acumulam. Esses conjuntos de dados não são passíveis de análises tradicionais.
Recentemente desenvolvemos um método de montagem global para datasets termolábil ligante DSC que produz o conjunto completo de parâmetros termodinâmicos que regem a dobradura biomolecular e vinculação de interações a partir de uma única experiência de ligante-limite referenciado para o termograma necessária para a biomolécula livre4. A análise reduz o tempo experimental e amostra exigido por ~ 10-fold em relação ao padrão de DSC de abordagens. Nós temos contabilizados para ligante conversão térmica por supondo que isto acontece durante a parte de alta temperatura de cada verificação onde a termograma não depende de concentração do ligante. Portanto, a concentração de ligante é uma constante dentro da parte da termograma que é usada para extrair os parâmetros termodinâmicos. Demonstrámos, além disso, como a constante de velocidade de conversão térmica de ligante pode ser obtido através da realização de um experimento de complementar com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura. Para sistemas onde a conversão térmica de ligante é menos dependente da temperatura (ou seja, sensivelmente ocorrendo em todas as temperaturas), a análise pode ser modificada para incluir a concentrações variáveis de ligante. Aqui vamos demonstrar este procedimento para o aptamer de DNA MN4 na presença da cocaína ligante termolábeis, que rapidamente se converte em benzoilecgonina em altas temperaturas (> 60 ° C). Quinino é usado como um controle negativo para thermolability de ligante não sofre conversão a estas temperaturas experimentais e também vincula a MN4. Descrevemos a aquisição de ligante termolábil DSC conjuntos de dados e sua análise rendendo parâmetros termodinâmicos e cinéticos da dobradura, ligação e ligante processos de conversão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificações e solução de problemas
Os detalhes da análise global de encaixe usado na Figura 1 e Figura 2 têm sido descritos anteriormente4. Aqui, podemos descrever aspectos práticos de executar e analisar experimentos de vinculação DSC com ligantes termolábil. Observe que uma linha de base do DSC obtidos para o ligante termolábil sozinho é subtraído do ligante + biomolécula datase…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V foi apoiado pelo programa de treinamento engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) em Bionanomachines e ciências naturais de McGill. A. K. M. e P. E. J. foram apoiados por subsídios NSERC 327028-09 (r. K. M) e 238562 (P. E. J.).
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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