Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions
Summary
Nous présentons un protocole pour la caractérisation rapide des biomoléculaire pliage et contraignant les interactions avec les ligands thermolabiles utilisant la calorimétrie différentielle à balayage.
Abstract
Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique puissante pour quantifier les paramètres thermodynamiques régissant biomoléculaire pliage et les interactions de liaison. Cette information est essentielle dans la conception de nouveaux composés pharmaceutiques. Cependant, de nombreux ligands pharmaceutiquement pertinentes sont chimiquement instables aux températures élevées utilisées dans les analyses de DSC. Ainsi, mesurer les interactions de liaison est difficile parce que les concentrations de ligands et de produits thermiquement converties sont en constante évolution au sein de la cellule du calorimètre. Nous présentons ici un protocole utilisant des ligands thermolabiles et DSC pour obtenir rapidement des informations thermodynamiques et cinétiques sur le pliage, une liaison et ligand procédés de conversion. Nous avons appliqué notre méthode à l’ADN aptamère MN4 qui se lie à la cocaïne de ligand thermolabile. À l’aide d’une nouvelle analyse de montage global qui tient compte de la conversion de ligand thermolabile, l’ensemble complet de pliage et de liaison des paramètres sont prélevés sur une paire d’expériences de DSC. En outre, nous montrons que la constante de vitesse de conversion thermolabile ligand peut être obtenue avec un seul dataset supplémentaire de DSC. Les lignes directrices pour identifier et analyser les données provenant de plusieurs scénarios plus complexes sont présentés, y compris l’agrégation irréversible de la biomolécule pliage lent, liaison lente et rapide épuisement du ligand thermolabile.
Introduction
Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une méthode puissante pour quantifiant liaison biomoléculaire et pliage des interactions1,2,3. Les points forts de DSC incluent sa capacité d’élucider contraignant et pliage des mécanismes et à céder les paramètres thermodynamiques correspondantes2,3. En outre, DSC peut être effectuée en solution dans des conditions physiologiques près et ne nécessite pas de marquage de la biomolécule ou ligands, par exemple, avec des fluorophores, spin-étiquettes ou isotopes nucléaires4. L’instrument balaye de température, mesure de la quantité de chaleur nécessaire pour dénaturer la biomolécule en présence et en absence de ligand. Les thermogrammes qui en résultent sont utilisées pour extraire les paramètres thermodynamiques qui régissent le ligand binding et processus de pliage. Les informations fournies par DSC ou d’autres techniques thermodynamiques sont essentielles pour guider la conception des médicaments ciblant des biomolécules1,5,6,7,8. Cependant, l’analyse répétée à des températures élevées (~ 60-100 ° C) peut s’avérer problématique. Par exemple, de nombreux composés pharmaceutiquement importants subissent une transposition ou décomposition après exposition à des températures élevées9,10,11, c’est-à-dire, ils sont thermolabiles. Examen de liaison généralement les interactions par DSC exige des scans multiples avant et arrière afin de vérifier la reproductibilité de la thermogramme pour analyses thermodynamiques12. Conversion thermique d’un ligand initiale à une forme secondaire présentant des caractéristiques de liaison modifiée entraîne des différences marquées dans la forme et la position des thermogrammes successifs, car la concentration de ligand initial diminue avec chaque scan tout en le produits de conversion thermique s’accumulent. Ces ensembles de données ne se prêtent pas aux analyses traditionnelles.
Nous avons récemment mis au point une méthode de lissage global datasets thermolabile ligand DSC qui cède l’ensemble complet des paramètres thermodynamiques qui régissent le pliage biomoléculaire et contraignant les interactions d’une seule expérience de ligand lié cité la thermogramme requise pour la biomolécule gratuit4. L’analyse réduit le temps expérimental et les échantillons requis par ~ 10 fois par rapport aux approches DSC standard. Nous avons représenté pour ligand conversion thermique en supposant que cela se passe pendant la phase de haute température de chaque balayage où le thermogramme ne dépend pas de la concentration de ligand. Par conséquent, la concentration de ligand est une constante dans la portion de la thermogramme qui est utilisé pour extraire des paramètres thermodynamiques. En outre, nous avons démontré comment la constante de vitesse pour la conversion thermique ligand peut être obtenue en effectuant une expérience supplémentaire avec une plus longue période d’équilibration de haute température. Pour les systèmes où la conversion thermique de ligand est moins dépendante de la température (c’est-à-diresurvenant de façon appréciable à toutes les températures), l’analyse peut être modifiée pour inclure des concentrations variables de ligand. Nous démontrons cette procédure pour l’ADN aptamère MN4 en présence de la cocaïne de ligand thermolabile, qui se transforme rapidement en benzoylecgonine à des températures élevées (> 60 ° C). La quinine est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité de ligand puisqu’il ne subit pas de conversion à ces températures expérimentales et lie également à MN4. Nous décrivons l’acquisition de ligand thermolabile DSC datasets et leur analyse, ce qui donne des paramètres thermodynamiques et cinétiques de la plier, une liaison et ligand des processus de conversion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifications et dépannage
Les détails de l’analyse du montage global utilisé dans la Figure 1 et Figure 2 ont été décrites précédemment4. Ici, nous exposons les aspects pratiques de la scène et analyse des expériences de liaison DSC avec des ligands thermolabiles. Notez qu’une ligne de base de DSC obtenues pour le ligand thermolabile seul est soustraite de ligand + biomolécule da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V était soutenue par les Sciences naturelles de McGill et le programme de formation de génie conseil recherche du Canada (CRSNG) en Bionanomachines. A. K. M. et P. E. J. appuyés par des subventions du CRSNG 327028-09 (A. K. M) et 238562 (E. J.).
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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