Kvantitative lokalisering af Golgi Protein af Imaging dens centrum af fluorescens masse
Summary
Den præcise lokalisering af Golgi beboere er afgørende for forståelsen af Golgi cellulære funktioner. Men konventionelle Optisk mikroskopi er afskåret fra løse sub-Golgi strukturen. Her beskriver vi protokol for en konventionel mikroskopi baseret super-resolution metode til at bestemme kvantitativt sub-Golgi lokalisering af et protein.
Abstract
Golgi kompleks består af seriefremstillede stablet membran cisternae, som kan yderligere inddeles i sub-Golgi regioner, herunder SNG-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi og trans-Golgi netværk. Cellulære funktioner af Golgi bestemmes af den karakteristiske distribution af sin bopæl proteiner. Konventionelle lysmikroskopi rumlige opløsning er for lav til at løse sub-Golgi struktur eller cisternae. Immuno-guld elektronmikroskopi er således en metode til at lokalisere et protein på sub-Golgi plan. Teknik og instrument er dog ud over evne af de fleste celle biologi labs. Her beskriver vi vores nyligt udviklede super-resolution metode kaldet Golgi protein lokalisering af imaging Centre of mass (lys) til systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein. LYS er baseret på standard fluorescens mærkning protokoller og konventionelle wide-felt eller Konfokal mikroskoper. Det drejer sig om kalibrering af kromatisk-Skift aberration af mikroskopiske systemet, image erhvervelse og efter købet analyse. Sub-Golgi lokaliseringen af en test protein udtrykkes kvantitativt lokalisering kvotienten. Der er fire vigtigste fordele ved lys; Det er hurtig, baseret på konventionelle metoder og værktøjer, lokalisering resultatet er kvantitative, og det frembyder ~ 30 nm praktiske opløsningen langs Golgi-aksen. Her beskriver vi de detaljerede protokollen af lys til at lokalisere en test Golgi protein.
Introduction
Golgi kompleks spiller væsentlige roller i sekretoriske/endocytic handel med proteiner og lipider (herefter laster) i pattedyrceller1,2,3. I Golgi, er laster ikke kun sorteret til forskellige subcellulære rum men også ændret ved forskellige typer af glykosylering. Den pattedyr Golgi kompleks omfatter talrige sideværts tilsluttede Golgi stakke, som typisk består af 4-11 stramt tilstødende og flad membran sække kaldet cisternae. De seriefremstillede stablet Golgi cisternae yderligere kategoriseres, fra den ene ende til den anden, som cis, mediale og trans-cisternae. På trans-side af en Golgi stak, trans-de fleste membran sac udvikler sig til en rørformet og reticulum membran netværk kaldet trans-Golgi netværk (TGN)4. I den sekretoriske pathway, laster stammer fra det endoplasmatiske reticulum (ER) Angiv en Golgi stak på sin cis-side og derefter sekventielt passere gennem mediale og trans-cisternae. Laster til sidst afslutte Golgi på trans-Golgi eller TGN destining plasma membran, endosomes eller sekretorisk granulat.
De molekylære og cellulære mekanismer af hvordan laster transit en Golgi stak og hvordan Golgi fastholder sin cisternal organisation forblive mystiske og er i øjeblikket stadig under en ophedet debat1. En af vanskelighederne på dette område er at Golgi cisternae kun kan løses under elektronmikroskopi (EM) siden opløsningen af et optisk mikroskop (~ 200 nm) er utilstrækkelige til at løse individuelle Golgi cisternae (< 100 nm i begge cisternal tykkelse og afstand). Sub-Golgi lokaliseringen af hjemmehørende proteiner og transit laster bestemmes derfor konventionelt immuno-guld EM. Men immuno-guld EM meget teknisk krævende og det er ud over evne af de fleste celle biologi labs. Selv om løsningen af EM kan være sub nanometer, opløsningen af den immuno-guld EM er stærkt hæmmet af antistof kompleks størrelse (primære plus den sekundær antistof) og guld partiklen, og det kan være værre end 20 nm. Derudover fås EM billeder fra 2D tynd-sektioner i stedet for en 3D globale visning af Golgi, hvilket kan føre til fejlagtige konklusioner alt efter den relative placering og orientering af 2D sektion5. For eksempel kan at studere en EM single-sektion ikke pålideligt differentiere en vesikel ud fra de retvinklede en tubulus, da begge kan vise identiske runde membran profiler. De nylige fremkomsten af super-resolution mikroskopi-teknikker, såsom 3D-strukturerede belysning mikroskopi (3D-SIM), stimuleret emission udtynding (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi ( STORM), gør det muligt at løse sub-Golgi strukturer under lys mikroskoper6. Men der er mindst fire ulemper, der kan i betydelig grad begrænse deres anvendelser i celle biologisk undersøgelse af Golgi. 1) aktuelle super-resolution teknikker kræver dyre og særlige hardwarekonfiguration, som er ud over de fleste celle biologi labs. 2) særlig fluorescens mærkning protokoller er behov for nogle super-opløsning teknikker. 3) selv om den bedste betingelse, hævder disse teknikker 20-110 nm i rumlige opløsning, kan den praktiske opløsning fremstillet i ægte prøver være meget værre. 4) i forhold til konventionelle mikroskopi, disse super-resolution teknikker stadig har vanskeligheder med at gennemføre multicolor, 3D eller live celle imaging, enten enkeltvis eller i kombination. Nok vigtigst, giver både immuno-guld EM og super-resolution mikroskopi-teknikker kvalitative i stedet for kvantitative lokalisering data.
Forsøger at delvist løse ovennævnte problemer, har vi for nylig udviklet en konventionel lysmikroskopi baseret metode, som er opkaldt Golgi protein lokalisering af imaging Centre of mass (lys), til systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein med en opløsning svarende til immuno-guld EM7. I denne metode, er Golgi i kulturperler pattedyrceller spredt som Golgi mini-stakke af behandling af nocodazole, en mikrotubulus depolymerizing stof. Omfattende undersøgelser har vist, at nocodazole-induceret Golgi mini-stakke (herefter Golgi mini-stakke) ligner indfødte Golgi stakke i både organisation og cellulære funktioner8,9,10, 11. Lokalisering kvotienten (LQ) af en test protein kan erhverves gennem lys og det betegner den kvantitative sub-Golgi lokalisering. Numeriske værdier for LQs kan sammenlignes og en LQ database med mere end 25 Golgi markører har været til rådighed.
Golgi mini-stakke er i lys, triple-mærket af endogene eller eksogent udtrykt GM130, GalT-mCherry og test protein (x). GM130 og GalT-mCherry, cis– og trans-Golgi markører henholdsvis12,13, levere referencepunkter. Den tredobbelte fluorescens, rød (R), grøn (G) og far-red (B), kunstigt vises som røde, grønne og blå, henholdsvis. Midten af fluorescens masse (herefter center) er vedtaget for at opnå sub-pixel opløsning. Golgi akse defineres som vektor fra center GM130 som GalT-mCherry. Golgi mini stack er modelleret som en cylindrisk struktur med uendelig rotational symmetri omkring Golgi akse. Derfor kan en Golgi mini stack yderligere modelleret som en endimensional struktur langs Golgi akse. LQ test protein x defineres som dxd1, hvor dx er afstanden fra midten af x som GM130, mens d1 er afstanden fra centrum af GalT-mCherry end GM130. Hvis midten af x er off-axis, bruges sin fremskrivning aksial afstand til beregning. Variabler, herunder Golgi akse, aksial vinkel, dx, d1, vinklen α og β, vinkel, for lys er skematisk illustreret i figur 1. LQ er uafhængig af Golgi aksial vinkel, selvom Golgi mini-stakke orientere tilfældigt i en celle.
Golgi mini-stakke vises inhomogene i billeder. Vi udviklet tre kriterier for at vælge analyzable Golgi mini-stakke for lys. 1) den signal-støj-forholdet kriterium, hvor forholdet mellem den samlede intensiteten af en Golgi mini stack til standardafvigelse (SD) i baggrunden er ≥ 30 i hver kanal. Dette kriterium er at sikre den positionering nøjagtighed af center of mass, som afhænger af signal-støj-forhold af Golgi mini-stakke. 2) den aksiale vinkel eller afstand kriterium, som kræver d1≥ 70 nm. d1 aftager med forhøjelsen af Golgi aksial vinkel. Når den aksiale vinkel nærmer sig 90° eller lodret, mini stakken bliver ikke-opløselige d1 nærmer sig 0. d1≥ 70 nm kan effektivt udelukke nær lodret Golgi mini-stakke. 3) co-linearitet kriteriet, hvor enten | tan α | eller | tan β | er ≤ 0,3. Dette kriterium sikrer, at de tre centre for en mini stack er tilstrækkeligt co-lineær for vores endimensional model af Golgi mini stack. Alle lys mikroskoper lider af kromatisk aberration, der kan alvorligt fordreje de relative position af rød, grøn og far-red fluorescens Centre. Kromatisk aberration af mikroskop systemer er eksperimentelt kalibreret af imaging 110 nm perler, som triple-mærket af rød, grøn og far-red fluorescens. For hver perle billede, midten af rød er defineret som den sande holdning af perle og kromatisk-skift af grønne og far-red Centre er monteret af første-ordens polynomiel funktioner. Centre af Golgi mini-stakke er udsat for de polynomiel funktioner til at korrigere de kromatiske forskydninger i grønne og far-red kanaler.
Gennem lys kan vi opnå en opløsning af ~ 30 nm langs Golgi akse under standardbetingelser. Vigtigere, giver det en systematisk metode til kvantitativt kort enhver Golgi protein. LYS kan udføres af konventionelle mikroskoper, såsom wide-felt eller Konfokal mikroskoper, ved hjælp af fælles fluorescens mærkning protokoller. Billedbehandling og databehandling kan tage så kort som en time. Gennem lys, har vi direkte demonstreret den progressive overgang af sekretoriske lasten fra cis– til trans-side af Golgi7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere, lokalisering af Golgi protein under den lysmikroskopi var hovedsagelig kvantificeres ved graden af korrelation eller overlapning af billedet af proteinet med billedet af en Golgi markør af kendte lokalisering15,16, 17. Den resulterende korrelation eller overlappende koefficient afspejler hvor tæt test proteinet til Golgi markør rumligt. Der er mindst tre forbehold for denne tilgang. Først korrelation eller overla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Storbritannien) for TPST1-EGFP DNA plasmid, samt Lakshmi Gitte Steen for at hjælpe med softwareoptimering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Medical Research Council (NMRC-CBRG-007/2012), Undervisningsministeriet (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 og 15/RG132 og AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) til ll
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
References
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
