تعريب كمية البروتين غولجي بالتصوير كتلته مركز الأسفار
Summary
توطين سكان غولجي دقيقة أمر ضروري لفهم وظائف غولجي الخلوي. المجهر الضوئي التقليدية غير قادر على تحليل هيكل sub-غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول لأسلوب الفحص المجهري التقليدي على أساس قرار فائقة لتحديد الكمية الترجمة sub-غولجي بروتين.
Abstract
ويتكون المجمع غولجي من الغشاء متسلسل مكدسة cisternae التي يمكن تصنيفها أيضا إلى مناطق فرعية-غولجي، بما في ذلك رابطة الدول المستقلة-غولجي، الآنسي-غولجي، عبر-غولجي و عبر-شبكة غولجي. الوظائف الخلوية من غولجي تتحدد بتوزيع المميزة البروتينات المقيم. القرار المكانية للفحص المجهري الخفيفة التقليدية منخفض جداً لحل الهيكل الفرعي-غولجي أو سيستيرناي. وهكذا، الميكروسكوب الإلكتروني المناعية والذهب أسلوب المفضل لترجمة بروتين على المستوى الفرعي-غولجي. ومع ذلك، تقنية وأداة تتجاوز قدرة معظم المعامل بيولوجيا الخلية. يصف لنا هنا لدينا طريقة وضعت مؤخرا القرار عظمى تسمى غولجي البروتين التعريب بالتصوير مراكز للإعلام (جليم) منهجياً وكمياً تعريب بروتين غولجي. جليم يستند إلى البروتوكولات القياسية fluorescence التوسيم والتقليدية واسع المجال أو مجاهر [كنفوكل]. أنها تنطوي على معايرة زيغ لوني تحول منظومة المجهرية، والحصول على صورة وتحليل ما بعد اكتساب. الترجمة sub-غولجي بروتين الاختبار كمياً يعبر كحاصل التعريب. وهناك أربع مزايا رئيسية من جليم؛ أنها سريعة، استناداً إلى الأساليب التقليدية وأدوات والتعريب والنتيجة الكمية، وأنه يتيح ~ 30 نانومتر القرار العملي على طول المحور غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول مفصلاً من جليم إلى ترجمة اختبار البروتين غولجي.
Introduction
مجمع غولجي تلعب أدواراً أساسية في الاتجار الافرازية/اندوسيتيك للبروتينات والدهون (يشار إليها فيما بعد من الشحنات) في خلايا الثدييات1،،من23. في غولجي، الشحنات لا فرز لمختلف المكونات الخلوية دون بل أيضا تعديل بواسطة أنواع مختلفة من جليكوسيليشن. يتألف المجمع غولجي الثدييات عديدة مكدسات غولجي المتصلة جانبياً، الذي يتكون عادة من 4-11 الحويصلات غشاء محكم المتاخمة ومسطحة تسمى سيستيرناي. سيستيرناي غولجي متسلسل مكدسة تصنف مزيد، من واحدة من نهاية إلى أخرى، رابطة الدول المستقلة، والانسي و عبر-سيستيرناي. في ترانس-الجانب كدسة غولجي، عبر-معظم غشاء الكيس يتطور إلى شبكة أنبوبية والشبكة غشاء يسمى ترانس-شبكة غولجي (TGN)4. في مسار الافرازية، إدخال الشحنات المستمدة من هيولى (ER) مكدس غولجي في رابطة الدول المستقلة-الجانب وثم التتابع يمر الآنسي و عبر-سيستيرناي. الشحنات في نهاية المطاف إنهاء غولجي في ترانس-ديستينينج غولجي أو TGN إلى غشاء البلازما أو اندوسوميس أو حبيبات افرازية.
الآليات الجزيئية والخلوية كيفية عبور الشحنات كدسة غولجي وكيف يحافظ غولجي تنظيم cisternal تظل غامضة ولا يزال قيد نقاش المحتدم1حاليا. واحدة من الصعوبات في هذا المجال أن cisternae غولجي يمكن حلها إلا تحت المجهر الإلكتروني (م) منذ حل المجهر الضوئي (~ 200 nm) غير كاف لحل cisternae غولجي الفردية (< 100 نانومتر في كلا سمك سيستيرنال والمسافة). ولذلك، تتحدد الترجمة sub-غولجي البروتينات المقيمين وعبور الشحنات تقليديا م المناعية والذهب. بيد أن م المناعية والذهب وتطالب جداً من الناحية الفنية وأنها تتجاوز قدرة معظم المعامل بيولوجيا الخلية. على الرغم من أن يمكن حل م نانومتر الفرعية، والقرار تتيحها م المناعية والذهب يعوقها كثيرا حجم جسم المعقدة (الابتدائية بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية) وجسيمات الذهب، ويمكن أن يكون أسوأ من 20 نانومتر. وعلاوة على ذلك، يتم الحصول على صور م من شرائح رقيقة 2D بدلاً من عرض ثلاثي الأبعاد عالمية غولجي، يمكن أن تؤدي إلى استنتاجات خاطئة استناداً إلى الموضع النسبي والتوجه ل قسم 2D5. على سبيل المثال، دراسة مقطع واحد م غير قادر على موثوق التفريق حويصلة من وجهة نظر متعامد أنبوب حيث يمكن أن يعرض كل ملامح الغشاء جولة مماثلة. الأخيرة ظهور تقنيات مجهرية فائقة القرار، مثل منظم 3D إضاءة مجهرية (3D-سيم)، وحفز الانبعاثات استنفاد (STED)، فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية ( العاصفة)، يجعل من الممكن لحل الهياكل الفرعية-غولجي تحت المجهر الخفيفة6. ومع ذلك، هناك مالا يقل عن أربعة من السلبيات التي يمكن أن تحد بشكل كبير استخداماتها في دراسة الخلية البيولوجية غولجي. 1) تقنيات فائقة القرار الحالي يتطلب تكوين الأجهزة باهظة الثمن وخاصة الذي أبعد من معظم المعامل بيولوجيا الخلية. 2) بروتوكولات التوسيم الأسفار الخاصة اللازمة لبعض التقنيات فائقة القرار. 3) وعلى الرغم من هذه التقنيات بموجب الشرط أفضل، المطالبة نانومتر 20-110 في القرار المكانية، القرار عملية الحصول على عينات حقيقية يمكن أن تكون أسوأ بكثير. 4) بالمقارنة بالفحص المجهري التقليدي، هذه التقنيات فائقة القرار لا تزال تواجه صعوبات في إجراء متعدد الألوان، 3D أو يعيش خلية التصوير، أما منفردة أو مجتمعة. ربما الأهم من ذلك، م المناعية والذهب وتقنيات مجهرية فائقة القرار العائد النوعي بدلاً من البيانات الكمية ومسلم.
محاولة جزئيا في حل المشاكل المذكورة أعلاه، وقد وضعنا مؤخرا أسلوب الفحص المجهري خفيفة تقليدية على أساس، الذي يدعى غولجي البروتين التعريب بالتصوير مراكز للإعلام (جليم)، منهجياً وكمياً تعريب غولجي البروتين بدقة تعادل م المناعية والذهب7. في هذا الأسلوب، ينتشر غولجي في خلايا الثدييات مثقف غولجي ميني-مداخن بمعاملة نوكودازولي، دواء ديبوليميريزينج ميكروتوبولي. وقد أثبتت الدراسات الواسعة أن الناجمة عن نوكودازولي غولجي ميني-مداخن (يشار إليها فيما بعد غولجي ميني-مداخن) تشبه مكدسات غولجي الأصلية في كل من المنظمة والوظائف الخلوية8،،من910، 11. حاصل التعريب (LQ) لاختبار البروتين يمكن الحصول عليها عن طريق جليم وأنها ترمز إلى الترجمة sub-غولجي الكمية. ويمكن مقارنة القيم العددية ل LQs وقاعدة LQ أكثر من 25 غولجي علامات كانت متاحة.
في جليم، غولجي ميني-مداخن المسماة ثلاثية GM130 الذاتية أو عن مناشئ وجالت مشري واختبار بروتين (x). GM130 وجالت-مشري، رابطة الدول المستقلة-و عبر-علامات غولجي على التوالي12،13، توفر نقطة مرجعية. الأخضر ثلاثية الأسفار، الأحمر (R)، (ز) واستعملنا (ب)، يتم عرض صورة مصطنعة كالأحمر والأخضر والأزرق، على التوالي. هو اعتمد مركز الكتلة الفلورية (يشار إليها فيما بعد مركز) لتحقيق القرار الفرعي بكسل. ويعرف المحور غولجي المتجه من مركز GM130 لتلك التي جالت مشري. وعلى غرار المكدس غولجي المصغر كهيكل أسطواني مع إنهائيه التماثل دوران حول محور غولجي. ولذلك، يمكن زيادة غرار غولجي كومة صغيرة كهيكل أحادي المحور غولجي. LQ من البروتين اختبار يعرف س دس/d1، الذي دx هو المسافة من المركز العاشر إلى من GM130، بينما د1 هي المسافة من مركز جالت-مشري لمن GM130. إذا كان مركز العاشر خارج المحور، يتم استخدام المسافة المحورية الإسقاط للحساب. المتغيرات، بما في ذلك غولجي المحور وزاوية المحوري، دس، د1، α زاوية وزاوية β، جليم تخطيطياً موضحة في الشكل 1. LQ مستقل من زاوية المحوري غولجي لو غولجي ميني-مداخن توجيه عشوائياً في خلية.
غولجي ميني-مداخن تظهر متنافرة في الصور. قمنا بتطوير ثلاثة معايير لتحديد أناليزابل غولجي ميني-مداخن جليم. 1) معيار نسبة الإشارة إلى الضجيج، الذي هو نسبة إجمالي كثافة غولجي كومة صغيرة للانحراف المعياري (SD) للخلفية ≥ 30 في كل قناة. هذا المعيار هو ضمان دقة تحديد المواقع الشامل للمركز، الذي يعتمد على نسبة إشارة إلى الضجيج غولجي ميني-مداخن. 2) معيار زاوية أو المسافة المحورية، الأمر الذي يتطلب د1≥ 70 نانومتر. د1 يتناقص مع زيادة الزاوية المحورية غولجي. عند الزاوية المحورية تقترب من 90° أو عمودي، يصبح كومة صغيرة غير الحل ك د1 يقترب من 0. د1≥ 70 نانومتر يمكن استبعاد فعالية قرب العمودي غولجي ميني-مداخن. 3) معيار co-الخطي، التي أما | تان α | أو | تان بيتا | هو ≤ 0.3. ويكفل هذا المعيار بما فيه الكفاية co الخطية لنموذجنا أحادي الأبعاد المكدس المصغر غولجي المراكز الثلاثة من كومة صغيرة. جميع المجاهر الخفيفة يعانون من زيغ التي يمكن أن تشوه خطير المواضع النسبية لمراكز ومضان أحمر وأخضر واستعملنا. زيغ نظم مجهر تجريبيا معايرة بالتصوير 110 نانومتر الخرز، والمسماة ثلاثية بالأسفار الحمراء والخضراء واستعملنا. لكل صورة حبة، وسط الأحمر يعرف الموقف الحقيقي من حبة ولوني تحولات من الأخضر واستعملنا مراكز مزودة بوظائف متعدد الحدود من الدرجة الأولى. مراكز غولجي ميني-مكدسات يتعرضون لوظائف متعدد الحدود لتصحيح اللوني التحولات في قنوات الأخضر واستعملنا.
من خلال جليم علينا التوصل إلى حل ل ~ 30 نانومتر على طول محور غولجي تحت الظروف القياسية. الأهم من ذلك، فإنه يوفر أسلوب المنهجي لتعيين أي البروتين غولجي كمياً. يمكن أن يؤديها جليم المجاهر التقليدية، مثل واسع المجال أو مجاهر [كنفوكل]، استخدام بروتوكولات وضع العلامات الفلورية شيوعاً. يمكن أن تأخذ بتصوير وتجهيز البيانات قصيرة قدر ساعة. جليم, أننا قد أظهر من خلال مباشرة الانتقال التدريجي من الشحنة الافرازية من رابطة الدول المستقلة-إلى ترانس-الجانب غولجي7.
Protocol
Representative Results
Discussion
سابقا، كانت أساسا كمياً التعريب بروتين غولجي تحت المجهر الخفيفة بدرجة الترابط أو التداخل في صورة البروتين بصورة علامة غولجي التعريب المعروفة15،16، 17. العلاقة الناتجة أو معامل تداخل يعكس مدى قرب اختبار البروتين علامة غولجي مكانياً. وهناك …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن أشكر “ستيفنس دال” (جامعة بريستول، بريستول، المملكة المتحدة) على بلازميد “الدنا” TPST1-اجفب، فضلا عن غوفنداراجان ناراسيمهان لاكشمي للمساعدة في تحسين البرامج. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك/كبرج/007/2012)، ووزارة التعليم (أكرف Tier1 RG 18/11، RG 48/13 و RG132/15 وأكرف Tier2 MOE2015-T2-2-073) إلى
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
References
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
