이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화
Summary
골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
Cis를 포함 하 여 하위 골 지역으로 더 분류 될 수 있다 직렬 스택된 막 cisternae 골 복잡 한 구성-골, 중간-골, 트랜스-골 및 트랜스-Golgi 네트워크. 골 세포 기능 그것의 거주 단백질의 특성 분포에 의해 결정 됩니다. 기존의 가벼운 현미경의 공간 해상도 하위 골 구조 또는 cisternae 해결 하려면 너무 낮습니다. 따라서, 면역-골드 전자 현미경 지역화 하위 골 수준에서 단백질을 선택 하는 방법 이다. 그러나, 기술과 악기는 대부분 세포 생물학 실험실의 기능을 넘어. 여기 이미징 센터의 질량 (GLIM) 체계적이 고 양적 Golgi 단백질을 지역화 하 여 골 단백질 지 방화 라는 우리의 최근에 개발한 슈퍼 해상도 방법을 설명 합니다. GLIM 표준 형광 라벨 프로토콜 및 일반적인 넓은 필드 또는 confocal 현미경을 기반으로 합니다. 그것은 현미경 시스템, 이미지 수집 및 사후 수집 분석의 시프트 반음계 수 차 보정을 포함 한다. 테스트의 하위 Golgi 지역화 지역화 몫으로 양적 표현 된다. GLIM;의 4 개 주요 이점이 있다 그것은 급속 한, 전통적인 방법과 도구에 따라, 지역화 결과 양적, 그리고 요 극 ~ 골 축 30 nm 실용적인 해상도. 여기는 지역화 테스트 Golgi 단백질 GLIM의 상세한 프로토콜에 설명 합니다.
Introduction
골 복잡 한 포유류 세포1,2,3분 비/endocytic 단백질과 지질 (이 화물)의 인신 매매에 필수적인 역할을 재생 합니다. 골에서 화물은 다양 한 하위 세포질 구획 정렬 뿐만 아니라 또한 다양 한 유형의 glycosylation 수정. 포유류 골 복잡 한 일반적으로 구성 된 4-11 밀접 하 게 인접 하 고 평평한 막 낭 cisternae 라는 수많은 옆으로 연결 된 골 스택 구성 되어 있습니다. 순차적으로 누적된 골 cisternae 더로 분류 됩니다, 다른 한쪽 끝에서 cis, 중간 및 트랜스-cisternae. 트랜스에서-Golgi 스택, 트랜스의 측면-대부분 막 sac 트랜스라고 하는 관 및 그물 막 네트워크로 개발-Golgi 네트워크 (TGN)4. 분 비 통로에서 바인딩과 그물 (응급실)에서 파생 된 화물의 cis에 Golgi 스택에 입력-측면 및 다음 순차적으로 통과 중간 및 트랜스-cisternae. 화물 결국 종료 트랜스에서 골-골 또는 TGN destining 원형질 막, endosomes 또는 분 비과 립.
어떻게 화물 운송 Golgi 스택 및 어떻게는 Golgi의 cisternal 조직 유지의 분자 및 세포 메커니즘 신비로운 남아 있다 고 현재 열띤된 토론1의 밑에 아직도. 이 분야에 있는 어려움 중 하나는 Golgi cisternae만 확인할 수 전자 현미경 (EM) 아래는 광학 현미경의 해상도 때문입니다 (~ 200 nm) 개별 Golgi cisternae 두 cisternal 두께에서 (< 100 nm를 해결 하기 위해 충분 하지 않습니다 그리고 거리)입니다. 따라서, 거주 단백질과 외계 화물의 하위 Golgi 지역화 통상 면역-골드 EM에 의해 결정 됩니다. 그러나, 면역-골드 그들은 매우 기술적으로 요구 하 고 그것은 대부분의 세포 생물학 실험실의 기능. EM의 해상도 하위 나노미터 수 면역-골드 엠에서 제공 하는 해상도 크게 복잡 한 항 체의 크기 (1 차 및 이차 항 체)와 금 입자에 의해 방해 하 고 20 보다 더 나쁠 수 있다 nm. 또한, EM 이미지 2D 얇은-섹션 대신 상대 위치 및 2D 섹션5의 방향에 따라 잘못 된 결론에 발생할 수 있습니다 골의 3 차원 세계 보기에서에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어 EM 단일 섹션 공부 아니다 안정적으로 구별할 수 있는 소포는 관의 직교 보기 때문에 둘 다 동일한 라운드 막 프로필을 표시할 수 있습니다. 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM) 같은 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술의 최근 출현 자극 방출 소모 (호텔 위치), photoactivated 지역화 현미경 (팜)와 추계 광 재건 현미경 ( 폭풍), 가벼운 현미경6에서 하위 골 구조를 해결 하기 위해 가능 하 게. 그러나, 적어도 4 개의 단점이 크게는 Golgi의 세포 생물 학적 연구에 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 1) 현재 슈퍼 해상도 기법 대부분 세포 생물학 실험실 넘어는 비싸고 특별 한 하드웨어 구성이 필요 합니다. 2) 특별 한 형광 라벨 프로토콜 슈퍼 해상도 기법 필요 합니다. 최고의 조건 하에서 이러한 기술을 공간 해상도에 20-110 nm 주장, 3) 하지만, 실제 샘플에서 얻은 실용적인 해상도 훨씬 더 수 있습니다. 4) 비교에 전통적인 현미경 검사 법, 이러한 슈퍼 해상도 기법 여전히 어려움에서 다 색, 3D 또는 라이브 셀 이미징, 단독으로 또는 조합에서. 아마 가장 중요 한 것은, 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 및 면역-골드 그들 항복 질적 양적 지역화 데이터 대신.
부분적으로 위에서 언급 한 문제를 해결 하려고, 우리는 최근 개발 센터의 질량 (GLIM), 체계적이 고 양적 지역화는 골을 이미징 하 여 골 단백질 지 방화 라는 기반으로 하는 기존의 가벼운 현미경 검사 법 방법 면역-골드 엠7의 동일한 해상도에서 단백질. 이 방법에서는, 경작된 한 포유류 세포에서 골은 골 지 미니-스택으로 nocodazole, microtubule depolymerizing 약물의 치료에 의해 분산 됩니다. 광범위 한 학문은 nocodazole 유도 골 미니-스택 (이 골 지 미니-스택)에 유사한 조직에 세포 기능8,,910, 기본 골 더미는 설명 했다 11. 테스트 단백질의 지역화 지 수 (LQ) GLIM 통해 취득 될 수 있다 그리고 그것은 양적 하위-Golgi 지역화를 나타냅니다. LQs의 숫자 값을 비교할 수 있습니다 하 고 25 개 이상의 골 마커의 LQ 데이터베이스 사용할 수 있다.
GLIM, 골 지 미니-스택 트리플 생 또는 것 표현 GM130, 갈 트 mCherry 및 테스트 단백질 (x)에 의해 표시 된 있습니다. GM130와 갈 트-mCherry, cis-및 트랜스-Golgi 마커 각각12,13, 제공 참조 포인트. 트리플 형광, 빨강 (R), 녹색 (G), 빨강 (B), 인위적으로 각각 빨강, 녹색 및 파랑으로 표시 됩니다. 형광 질량 (이 하 센터)의 센터 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위하여 채택 된다. 골 축 GalT mCherry의 GM130의 센터에서 벡터로 정의 됩니다. 골 지 미니 스택 Golgi 축을 무한 회전 대칭 구조를 원통형으로 모델링 됩니다. 따라서, 골 지 미니 스택 골 축 1 차원 구조 더 모델링 될 수 있습니다. LQ 테스트 단백질의 x dx/d1, 있는 dx GM130의 x의 중심 으로부터 거리 d1 은 GM130의 갈 트 mCherry의 센터에서 거리로 정의 됩니다. X의 중심 축에서 인 경우에, 그것의 프로젝션 축 거리 계산을 위해 사용 됩니다. 골 축, 축 각도, dx, d1, 각도 α와 각도 β를 포함 하 여 GLIM에 대 한 변수는 그림 1에서 개요로 설명 된다. LQ는 Golgi 미니-스택 방향 셀에 무작위로 비록 골 축 각도 무관 합니다.
골 지 미니-스택 휘도가 이미지에 나타납니다. 우리는 GLIM에 대 한 analyzable 골 미니-스택 선택 하 세 기준 개발. 골 지 미니 스택 백그라운드의 표준 편차 (SD)의 총 강도의 비율 ≥ 30 각 채널에는, 1)는 신호 대 잡음 비율 기준. 이 표준은 골 미니-스택의 신호 대 잡음 비율에 달려 있는 질량의 중심의 위치 정확도 지키기 위하여 이다. 2) 축 각도 또는 거리 기준을는 d1≥ 70 nm. d1 골 축 각도의 증가 함께 감소합니다. 때 축 각도 90 °에 도달 또는 수직, 미니 스택 d1 으로 확인할 수 없는 0에 접근 하는. d1≥ 70 nm 세로 골 지 미니-스택 근처 효과적으로 제외할 수 있습니다. 어느 하나에서 3) co 선형성 기준 | α 탄 | 또는 | β 탄 | ≤ 0.3입니다. 이 기준 미니 스택 세 센터는 골 지 미니 스택 1 차원 모델에 대 한 공동 선형 충분히 보장 합니다. 모든 가벼운 현미경 빨강, 녹색 및 빨강 형광 센터의 상대적 위치를 왜곡 심각 하 게 수 있는 색수차에서 고통. 색수차 현미경 시스템의 실험적으로 110 nm 구슬, 트리플-이라고 표시 된 빨간색, 녹색 및 빨강 형광을 이미징 하 여 보정 됩니다. 각 구슬 이미지에 대 한 레드의 중심은 구슬의 진정한 위치도 정의 하며 반음계 녹색과 빨강 센터의 교대 있습니다 1 차 다항식 함수. 골 지 미니-스택 센터 녹색 및 빨강 채널의 색채 변화를 해결 하기 위해 다항식 함수를 받게 됩니다.
GLIM 통해 우리의 해상도 얻을 수 있습니다 ~ 30 nm 표준 조건 하에서 골 축. 중요 한 것은, 양적 어떤 골 단백질 지도 하는 체계적인 방법을 제공 합니다. GLIM는 넓은 필드와 같은 기존의 현미경 또는 confocal 현미경, 일반적인 형광 라벨 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이미징 및 데이터 처리는 짧은 한 시간 걸릴 수 있습니다. GLIM를 통해 우리는 직접 증명 분 비 화물의 진보적인 전환에서 cis– 트랜스–7골 측면.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전, 가벼운 현미경 검사 법에서 골 지 단백질의 지 방화는 주로 상관 관계 또는 알려진된 지역화15,16, Golgi 마커 이미지와 단백질의 이미지의 중첩의 정도 의해 계량 17. 결과 상관 관계 또는 겹치는 계수 얼마나 가까운 테스트 단백질이 골 마커를 공간적으로 반영 합니다. 이 접근에 대 한 적어도 3 개의 경고가 있다. 첫째, 상?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 소프트웨어 최적화와 도움 뿐만 아니라 락 쉬 미와 Narasimhan Govindarajan TPST1 EGFP DNA 플라스 미드, 디 스티븐 스 (브리스톨의 대학, 브리스톨, 영국) 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 L.L. 국립 의학 연구 위원회 (NMRC/CBRG/007/2012), 교육 (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 및 RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-t 2-2-073)에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
References
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