뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용
Summary
이 프로토콜은 표준 시험관 전기 생리학 장비를 위해 최근에 개발 된 시스템을 사용하여 자동 이미지 유도 패치 클램프 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
전체 세포 패치 클램프는 단일 세포의 전기적 특성을 측정하는 금 표준 방법입니다. 그러나 체외 수정 패치 클램프는 복잡하고 사용자 조작 및 제어에 대한 높은 의존성으로 인해 도전적이고 낮은 처리량의 기술로 남아 있습니다. 이 원고는 급성 뇌 절편 에서 시험관 전체 세포 패치 클램프 실험을위한 이미지 가이드 자동 패치 클램프 시스템을 시연합니다. 우리 시스템은 형광 표식 된 세포를 검출하고 마이크로 조작기와 내부 피펫 압력 제어를 사용하여 완전 자동 패칭을 목표로 컴퓨터 시각 기반 알고리즘을 구현합니다. 전체 프로세스는 인간의 개입에 대한 최소한의 요구 사항만으로 고도로 자동화되어 있습니다. 전기 저항 및 내부 피펫 압력을 포함한 실시간 실험 정보는 향후 분석 및 다른 세포 유형의 최적화를 위해 전자적으로 문서화됩니다. 우리의 체계는 급성 brai의 문맥에서 기술 되더라도n 슬라이스 기록을 포함 해 분리 된 뉴런, organotypic slice culture 및 기타 비 연결 세포 유형의 자동화 된 이미지 유도 패치 클램프에도 적용 할 수 있습니다.
Introduction
패치 클램프 기술은 제 1 막 흥분성의 이온 채널을 연구 1970 Neher 및 Sakmann에 의해 개발되었다. 그 이후 패치 클램핑은 뉴런, 심근 세포, Xenopus 난 모세포 및 인공 리포좀을 포함하여 다양한 세포 유형에서 세포, 시냅스 및 회로 수준 (인 비트로 및 체내 모두) 에서 다양한 대상에 대한 연구에 적용되었습니다 2 . 이 과정은 관심 세포의 정확한 식별 및 표적화, 세포에 근접하여 패치 피펫을 이동시키는 복잡한 마이크로 매니퓰레이터 제어, 적당한 시간에 피펫에 양성 및 음성 압박을 가하여 꽉 조이는 gigaseal 패치를 확립하고, 전체 셀 패치 구성을 설정하기위한 침입 등이 있습니다. 패치 클램핑은 일반적으로 수동으로 수행되며 마스터하기 위해 광범위한 교육이 필요합니다. 패치를 경험 한 연구원이라 할지라도클램프, 성공률은 상대적으로 낮습니다. 보다 최근에는 패치 클램프 실험을 자동화하기위한 몇 가지 시도가있었습니다. 자동화를 달성하기 위해 두 가지 주요 전략이 개발되었습니다. 표준 패치 클램프 장비를 강화하여 패치 프로세스를 자동 제어하고 새로운 장비 및 기술을 처음부터 설계합니다. 이전 전략은 기존 하드웨어에 적용 할 수 있으며 생체 내 blind patch clamp 3 , 4 , 5 , 급성 뇌 절편의 in vitro patch clamp, organotypic slice culture 및 cultured dissociated neurons 6을 포함하여 다양한 패치 클램프 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. . 그것은 다수의 미세 조작기 동시에 7을 사용하여 복잡한 로컬 회로 심문을 가능하게한다. 평면 패치 방법은 새로운 개발 전략의 한 예이며 동시에 높은 처리량을 달성 할 수 있습니다약물 스크리닝 목적으로 현탁액에있는 세포의 아치 클램프 8 . 그러나, 평면 패치 방법은 모든 세포 유형, 특히 긴 과정을 갖는 뉴런 또는 광범위한 연결을 포함하는 손상되지 않은 회로에 적용 가능하지 않다. 이는 기존의 패치 클램프 기술의 핵심 이점 인 신경계의 복잡한 회로를 매핑하는 데 그 적용을 제한합니다.
우리는 표준 패치 클램프 하드웨어를 보강함으로써 체외에서 수동 패치 클램프 프로세스를 자동화하는 시스템을 개발했습니다. 당사의 시스템 인 Autopatcher IG는 자동 피펫 보정, 형광 셀 타겟 식별, 피펫 이동 자동 제어, 자동 전체 셀 패칭 및 데이터 기록을 제공합니다. 이 시스템은 여러 깊이의 뇌 조각 이미지를 자동으로 수집 할 수 있습니다. 컴퓨터 비전을 사용하여 분석. 형광으로 표지 된 세포의 좌표를 포함한 정보를 추출합니다. 이 정보는관심 대상 세포를 표적화하고 자동으로 패치하는 데 사용됩니다. 이 소프트웨어는 여러 오픈 소스 라이브러리를 사용하여 무료 오픈 소스 프로그래밍 언어 인 Python으로 작성되었습니다. 이것은 다른 연구자들에게 접근성을 보장하고 전기 생리학 실험의 재현성과 엄격 성을 향상시킵니다. 이 시스템은 추가 하드웨어가 여기에 설명 된 현재 시스템과 쉽게 인터페이스 될 수 있도록 모듈 식 설계를 갖추고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 체외에서 자동 이미지 유도 패치 클램프 녹음 을 위한 방법을 설명합니다. 이 프로세스의 핵심 단계는 다음과 같이 요약됩니다. 첫째, 컴퓨터 비전은 현미경을 통해 얻은 일련의 이미지를 사용하여 피펫 팁을 자동으로 인식하는 데 사용됩니다. 이 정보는 현미경과 조작자 좌표계 간의 좌표 변환 함수를 계산하는 데 사용됩니다. 컴퓨터 비전은 형광 표식 된 세포를 자?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
화이트 홀 재단 (Whitehall Foundation)의 재정 지원에 감사드립니다. 소중한 의견에 대해 사무엘 T 키신저 (Samuel T. Kissinger)에게 감사드립니다.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
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- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
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