تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء التلقائية الموجهة تصويرا التصحيح المشبك التجارب باستخدام نظام وضعت مؤخرا للمعايير في المختبر الكهربية المعدات.
Abstract
كله خلية التصحيح المشبك هو طريقة الذهب القياسية لقياس الخصائص الكهربائية للخلايا واحدة. ومع ذلك، يبقى في المختبر التصحيح المشبك تقنية صعبة وانخفاض الإنتاجية بسبب تعقيدها والاعتماد العالي على تشغيل المستخدم والسيطرة عليها. هذه المخطوطة يدل على نظام التوجيه التلقائي المشبك صورة موجهة لفي المختبر خلية كاملة التصحيح المشبك التجارب في شرائح الدماغ الحادة. يقوم نظامنا بتنفيذ خوارزمية تستند إلى رؤية الكمبيوتر للكشف عن الخلايا فلورزنتلي المسمى واستهدافها لتصحيح التلقائي بالكامل باستخدام ميكرومانيبولاتور والسيطرة على ضغط ماصة الداخلية. العملية بأكملها مؤتمتة للغاية، مع الحد الأدنى من متطلبات التدخل البشري. يتم توثيق المعلومات التجريبية في الوقت الحقيقي، بما في ذلك المقاومة الكهربائية والضغط الداخلي ماصة، إلكترونيا للتحليل في المستقبل ولتحسين أنواع الخلايا المختلفة. على الرغم من أن يتم وصف نظامنا في سياق البراي الحادن التسجيلات شريحة، ويمكن أيضا أن تطبق على المشبك التصحيح الآلي الموجهة الصورة من الخلايا العصبية فصلها، والثقافات شريحة عضوي النمط، وغيرها من أنواع الخلايا غير العصبية.
Introduction
وقد وضعت تقنية التصحيح المشبك لأول مرة من قبل نهر وساكمان في 1970s لدراسة القنوات الأيونية من الأغشية المنشطة 1 . ومنذ ذلك الحين، تم تطبيق لقط التصحيح لدراسة العديد من المواضيع المختلفة على مستوى الخلوية، متشابك، ودائرة، سواء في المختبر وفي الجسم الحي في العديد من أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا العصبية، العضلية، البويضات القيطم، والليبوزومات الاصطناعية 2 . هذه العملية تنطوي على تحديد الصحيح واستهداف خلية من الفائدة، والتحكم ميكرومانيبولاتور معقدة لنقل ماصة التصحيح على مقربة من الخلية، وتطبيق الضغط الإيجابي والسلبي إلى ماصة في الوقت المناسب لإنشاء رقعة ضيقة ضيق، وكسر في إنشاء تكوين خلية كاملة التصحيح. وعادة ما يتم إجراء التصحيح اليدوي يدويا ويتطلب تدريبا مكثفا لإتقان. حتى بالنسبة للباحث من ذوي الخبرة مع التصحيحالمشبك، ونسبة نجاح منخفضة نسبيا. في الآونة الأخيرة، وقد بذلت عدة محاولات لأتمتة التجارب التصحيح المشبك. وقد تطورت استراتيجيتان رئيسيتان لتحقيق الأتمتة: زيادة معدات التصحيح القياسية المشبك لتوفير التحكم الآلي لعملية الترقيع وتصميم المعدات والتقنيات الجديدة من الألف إلى الياء. الاستراتيجية السابقة قابلة للتكيف مع الأجهزة الموجودة، ويمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات المشبك التصحيح، بما في ذلك في الجسم الحي التصحيح التصحيح أعمى 3 ، 4 ، 5 ، في المختبر التصحيح المشبك من شرائح الدماغ الحادة، الثقافات شريحة عضوي النمط، والخلايا العصبية فصلها المستزرعة 6 . فإنه يتيح استجواب الدوائر المحلية المعقدة باستخدام ميكرومانيبولاتورس متعددة في وقت واحد 7 . طريقة التصحيح مستو هو مثال على استراتيجية التنمية الجديدة، والتي يمكن تحقيق الإنتاجية العالية في وقت واحد صأتش المشبك من الخلايا في تعليق لأغراض فحص المخدرات 8 . ومع ذلك، فإن طريقة التصحيح مستو لا ينطبق على جميع أنواع الخلايا، وخاصة الخلايا العصبية مع عمليات طويلة أو الدوائر سليمة تحتوي على اتصالات واسعة. وهذا يحد من تطبيقه لرسم الخرائط الدوائر المعقدة من الجهاز العصبي، وهو ميزة رئيسية للتكنولوجيا المشبك التصحيح التقليدية.
قمنا بتطوير نظام بأتمتة عملية التصحيح اليدوي المشبك في المختبر عن طريق زيادة الأجهزة التصحيح القياسية المشبك. نظامنا، أوتوباتشر إيغ، يوفر التلقائي ماصة المعايرة، وتحديد هوية الخلايا الفلورية، والتحكم الآلي للحركة ماصة، التلقائي كامل خلية الترقيع، وتسجيل البيانات. يمكن للنظام تلقائيا الحصول على صور متعددة من شرائح الدماغ في أعماق مختلفة. وتحليلها باستخدام رؤية الكمبيوتر. واستخراج المعلومات، بما في ذلك إحداثيات الخلايا فلورزنتلي المسمى. ويمكن أن تكون هذه المعلومات بعد ذلكتستخدم لاستهداف وتصحيح الخلايا تلقائيا من الفائدة. البرنامج مكتوب بلغة بيثون، وهي لغة برمجة حرة ومفتوحة المصدر، تستخدم عدة مكتبات مفتوحة المصدر. وهذا يضمن إمكانية الوصول إلى الباحثين الآخرين ويحسن استنساخ ودقة التجارب الكهربية. يحتوي النظام على تصميم وحدات، بحيث يمكن بسهولة أن تكون الأجهزة الإضافية متداخلة مع النظام الحالي أظهرت هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل الصور التلقائي المشبك التصحيح الموجهة في المختبر . وتتلخص الخطوات الرئيسية في هذه العملية على النحو التالي. أولا، يتم استخدام رؤية الكمبيوتر لتعترف تلقائيا طرف ماصة باستخدام سلسلة من الصور المكتسبة عن طريق المجهر. ثم يتم استخدام هذه ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للدعم المالي من مؤسسة وايتهال. نود أن نشكر صموئيل ت. كيسنجر على التعليقات القيمة.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
