Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.
Abstract
Voll-Zell-Patch-Clamp ist die Gold-Standard-Methode, um die elektrischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu messen. Allerdings bleibt die In-vitro- Patch-Clamp aufgrund ihrer Komplexität und ihrer hohen Abhängigkeit von Benutzerbetrieb und -steuerung eine anspruchsvolle und leistungsstarke Technik. Dieses Manuskript zeigt ein bildgeführtes automatisches Patch-Clamp-System für in-vitro- Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in akuten Hirnschnitten. Unser System implementiert einen computervisionsbasierten Algorithmus, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren und sie zum vollautomatischen Patching mit einem Mikromanipulator und einer internen Pipettendruckkontrolle zu zielen. Der gesamte Prozess ist hoch automatisiert, mit minimalen Anforderungen für menschliches Eingreifen. Echtzeit-experimentelle Informationen, einschließlich elektrischer Widerstand und interner Pipettendruck, werden elektronisch für die zukünftige Analyse und für die Optimierung auf verschiedene Zelltypen dokumentiert. Obwohl unser System im Kontext der akuten brai beschrieben wirdN Slice-Aufnahmen kann es auch auf die automatisierte bildgeführte Patch-Clamp von dissoziierten Neuronen, organotypischen Slice-Kulturen und anderen nicht-neuronalen Zelltypen angewendet werden.
Introduction
Die Patch – Clamp – Technik wurde zuerst von Neher und Sakmann in den 1970er Jahren entwickelt , um die Ionenkanäle von erregbaren Membranen 1 zu studieren. Seitdem wurde die Patch-Clamping auf die Untersuchung vieler verschiedener Subjekte auf zellulärer, synaptischer und Circuit-Ebene angewendet – sowohl in vitro als auch in vivo – in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten, Xenopus-Oozyten und künstlichen Liposomen 2 . Dieser Prozess beinhaltet die korrekte Identifizierung und Ausrichtung einer Zelle von Interesse, komplizierte Mikromanipulator-Steuerung, um die Patch-Pipette in der Nähe der Zelle zu bewegen, die Anwendung von positiven und negativen Druck auf die Pipette zur richtigen Zeit, um eine enge Gigaseal Patch, Und ein Einbruch, um eine Ganzzell-Patch-Konfiguration zu etablieren. Patch-Clamping wird in der Regel manuell durchgeführt und erfordert umfangreiche Schulungen zu meistern. Auch für einen Forscher, der mit dem Patch erlebt wurdeKlemme, die Erfolgsquote ist relativ gering. In jüngster Zeit wurden mehrere Versuche unternommen, Patch-Clamp-Experimente zu automatisieren. Zwei Hauptstrategien haben sich entwickelt, um die Automatisierung zu erreichen: die Erweiterung der Standard-Patch-Clamp-Ausrüstung, um die automatische Steuerung des Patching-Prozesses und die Gestaltung neuer Geräte und Techniken von Grund auf zu ermöglichen. Die frühere Strategie ist an vorhandene Hardware anpassbar und kann in einer Vielzahl von Patch-Clamp-Anwendungen verwendet werden, einschließlich in vivo Blind Patch Clamp 3 , 4 , 5 , in vitro Patch Clamp von akuten Hirnschnitten, organotypischen Slice Kulturen und kultivierten dissoziierten Neuronen 6 . Es ermöglicht die Abfrage von komplexen lokalen Schaltungen durch die Verwendung mehrerer Mikromanipulatoren gleichzeitig 7 . Die Planar-Patch-Methode ist ein Beispiel für die neue Entwicklungsstrategie, die gleichzeitig den Hochdurchsatz erreichen kannAtch Klemme von Zellen in Suspension für Drogen-Screening-Zwecke 8 . Allerdings ist das Planar-Patch-Verfahren nicht für alle Zelltypen, insbesondere für Neuronen mit langen Prozessen oder intakten Schaltungen, die umfangreiche Verbindungen enthalten, anwendbar. Dies beschränkt seine Anwendung auf die Abbildung der komplizierten Schaltungen des Nervensystems, was ein wichtiger Vorteil der traditionellen Patch-Clamp-Technologie ist.
Wir haben ein System entwickelt, das den manuellen Patch-Clamp-Prozess in vitro automatisiert, indem er Standard-Patch-Clamp-Hardware erweitert. Unser System, Autopatcher IG, bietet automatische Pipettenkalibrierung, Fluoreszenzzelle Zielidentifikation, automatische Steuerung der Pipettenbewegung, automatisches Ganzzellpatching und Datenlogging. Das System kann automatisch mehrere Bilder von Gehirnscheiben in verschiedenen Tiefen erwerben; Analysiere sie mit Computer Vision; Und extrahieren Informationen, einschließlich der Koordinaten von fluoreszenzmarkierten Zellen. Diese Information kann dann seinVerwendet, um zu zielen und automatisch patch Zellen von Interesse. Die Software ist in Python geschrieben – eine freie, Open-Source-Programmiersprache – mit mehreren Open-Source-Bibliotheken. Dies sorgt für die Zugänglichkeit für andere Forscher und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge der elektrophysiologischen Experimente. Das System ist modular aufgebaut, so dass zusätzliche Hardware problemlos mit dem hier dargestellten System verbunden werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode für automatische bildgeführte Patch-Clamp-Aufnahmen in vitro . Die wichtigsten Schritte in diesem Prozess sind wie folgt zusammengefasst. Zuerst wird Computer Vision verwendet, um die Pipettenspitze automatisch mit einer Reihe von Bildern zu erkennen, die über ein Mikroskop aufgenommen wurden. Diese Information wird dann verwendet, um die Koordinatentransformationsfunktion zwischen dem Mikroskop und den Manipulator-Koordinatensystemen zu berechnen. Computer Vision wird verwe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der Whitehall Foundation. Wir danken Samuel T. Kissinger für die wertvollen Kommentare.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
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