ब्रेन स्लाइस में न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए स्वचालित छवि-निर्देशित पैच दबाना का आवेदन
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हाल ही में इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरण में मानक के लिए विकसित की गई प्रणाली का उपयोग करते हुए स्वचालित छवि-निर्देशित पैच-क्लैंप प्रयोग करने के लिए।
Abstract
पूरे सेल पैच दबाना एकल कोशिकाओं के विद्युत गुणों को मापने के लिए सोने की मानक विधि है। हालांकि, इन विट्रो पैच क्लैंप एक चुनौतीपूर्ण और निम्न-थ्रूपुट तकनीक है क्योंकि इसकी जटिलता और उपयोगकर्ता संचालन और नियंत्रण पर उच्च निर्भरता है। यह पांडुलिपि तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में इन विट्रो पूरे सेल पैच क्लैंप प्रयोगों के लिए छवि-निर्देशित स्वचालित पैच दबाना प्रणाली को दर्शाता है। हमारी प्रणाली फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक कंप्यूटर विजन-आधारित एल्गोरिथ्म लागू करती है और उन्हें माइक्रोमैनेप्युलेटर और आंतरिक विंदुक दबाव नियंत्रण का उपयोग करके पूरी तरह से स्वत: पैचिंग के लिए लक्षित करती है। मानवीय हस्तक्षेप के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ पूरी प्रक्रिया अत्यधिक स्वचालित होती है। विद्युत प्रतिरोध और आंतरिक विंदुक दबाव सहित वास्तविक समय की प्रयोगात्मक जानकारी, भविष्य के विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉनिक रूप से दस्तावेज की जाती हैं और विभिन्न प्रकार के सेल के अनुकूलन के लिए हालांकि हमारी प्रणाली तीव्र ब्राइ के संदर्भ में वर्णित हैN टुकड़ा रिकॉर्डिंग, यह अलग-अलग न्यूरॉन्स, अंगोटीपीक स्लाइस संस्कृतियों और अन्य गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों के स्वचालित चित्र-निर्देशित पैच क्लैंप पर भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
पैच दबाना तकनीक सबसे पहले 1 9 70 में नेहर और सकमन द्वारा विकसित की गई थी ताकि उत्तेजक झिल्ली 1 के ईओण चैनलों का अध्ययन किया जा सके। तब से, पैच क्लैंपिंग को सेल्यूलर, अननैप्टिक और सर्किट स्तर पर कई विभिन्न विषयों के अध्ययन में लागू किया गया है- इन दोनों में विट्रो और विवो में कई अलग-अलग प्रकार के कोशिकाएं हैं जिनमें न्यूरॉन्स, कार्डियोयोमायोसाइट्स, ज़िनोपस ओक्साइट्स और कृत्रिम लिपोसोम 2 शामिल हैं। । इस प्रक्रिया में सेल के करीब निकटता में पैच विंदुक को स्थानांतरित करने के लिए हित के एक सेल, जटिल माइक्रोमैनलिपुलेटर नियंत्रण का सही पहचान और लक्ष्यीकरण शामिल है, सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के प्रयोग को उचित समय पर पिपेट के लिए एक तंग गिगैसियल पैच स्थापित करने के लिए, और पूरे सेल पैच कॉन्फ़िगरेशन को स्थापित करने के लिए ब्रेक-इन। पैच क्लैंपिंग आमतौर पर मैन्युअल रूप से आयोजित किया जाता है और मास्टर के लिए व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यहां तक कि एक शोधकर्ता के लिए पैच के साथ अनुभव कियादबाना, सफलता दर अपेक्षाकृत कम है हाल ही में, पैच-दबाना प्रयोगों को स्वचालित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं स्वचालन को पूरा करने के लिए दो मुख्य रणनीतियों का विकास किया गया है: पैचिंग प्रक्रिया के स्वचालित नियंत्रण और जमीन से नए उपकरणों और तकनीकों के डिजाइन को प्रदान करने के लिए मानक पैच क्लैंप उपकरणों को बढ़ाने के लिए। पूर्व रणनीति मौजूदा हार्डवेयर के लिए अनुकूल है और इन विवो अंधा पैच क्लैंप 3, 4, 5, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की इन विट्रो पैच क्लैंप, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में सहित पैच क्लैंप अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है, और सुसंस्कृत अलग न्यूरॉन्स 6 । यह जटिल स्थानीय सर्किटों की पूछताछ के साथ-साथ कई माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके 7 को सक्षम करता है । प्लानर पैच पद्धति, नई विकास रणनीति का एक उदाहरण है, जो उच्च-थ्रुथुट युगपैलिक पी को हासिल कर सकती हैदवा स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए निलंबन में कोशिकाओं के atch क्लैंप 8 हालांकि, प्लानर पैच पद्धति सभी प्रकार की कोशिकाओं, विशेष रूप से लंबी प्रक्रियाओं के साथ न्यूरॉन्स या व्यापक कनेक्शंस वाले बरकरार सर्किटों पर लागू नहीं होती है। यह तंत्रिका तंत्र की जटिल सर्किट को मैप करने के लिए अपने आवेदन को सीमित करता है, जो पारंपरिक पैच दबाना प्रौद्योगिकी का एक महत्वपूर्ण लाभ है।
हमने एक ऐसी प्रणाली विकसित की है जो मानक पैच क्लैंप हार्डवेयर को बढ़ाकर इन विट्रो में मैन्युअल पैच दबाना प्रक्रिया को स्वचालित करता है। हमारी प्रणाली, ऑटोप्टेचर आईजी, स्वचालित विंदुक अंशांकन, फ्लोरोसेंट सेल लक्ष्य पहचान, विंदुक आंदोलन के स्वत: नियंत्रण, स्वत: पूरे सेल पैचिंग, और डेटा लॉगिंग प्रदान करता है। सिस्टम स्वचालित रूप से विभिन्न गहराई पर मस्तिष्क स्लाइस की कई छवियां प्राप्त कर सकता है; उन्हें कंप्यूटर दृष्टि का विश्लेषण; और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोशिकाओं के निर्देशांक सहित जानकारी निकालने। यह जानकारी तब हो सकती हैलक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और स्वचालित रूप से ब्याज की पैच कोशिकाओं। सॉफ्टवेयर पायथन में लिखा है- एक मुक्त, खुला स्रोत प्रोग्रामिंग भाषा- कई खुले स्रोत पुस्तकालयों का उपयोग कर। यह अन्य शोधकर्ताओं के लिए इसकी पहुंच सुनिश्चित करता है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों की पुनरुत्पादकता और कठोरता को सुधारता है। सिस्टम में एक मॉड्यूलर डिज़ाइन है, जैसे कि वर्तमान हार्डवेयर के साथ अतिरिक्त हार्डवेयर आसानी से इंटरफ़ेस किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम इन विट्रो में स्वचालित छवि-निर्देशित पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम संक्षेप निम्नानुसार हैं: सबसे पहले, माइक्रोस्कोप के माध्यम से …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम व्हाइटहॉल फाउंडेशन से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं हम बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए शमूएल टी। किसिंजर को धन्यवाद देना चाहेंगे।
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
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