Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor
Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför automatiska bildstyrda patch-clamp-experiment med ett system som nyligen utvecklats för standard in vitro- elektrofysiologiprodukter.
Abstract
Hela cellplåster är standardmetoden för att mäta de enskilda cellernas elektriska egenskaper. In vitro patch clampen är dock en utmanande och låg genomströmningsteknik på grund av dess komplexitet och höga beroende av användarens drift och kontroll. Detta manuskript demonstrerar ett bildstyrt automatiskt patch-klämsystem för in vitro -experiment med helcellsplastklem i akuta hjärnskivor. Vårt system implementerar en datorvisionsbaserad algoritm för att detektera fluorescensmärkta celler och att rikta dem till helautomatisk patching med hjälp av en mikromekanipulator och intern pipetttryckskontroll. Hela processen är mycket automatiserad, med minimala krav på mänsklig intervention. Realtids experimentell information, inklusive elektrisk resistans och internt pipetttryck, dokumenteras elektroniskt för framtida analys och för optimering till olika celltyper. Även om vårt system beskrivs i samband med akut braiN-skivinspelningar kan den också appliceras på den automatiska bildstyrda patchklemmen av dissocierade neuroner, organotypa skivkulturer och andra icke-neuronala celltyper.
Introduction
Plåstringstekniken utvecklades först av Neher och Sakmann på 1970-talet för att studera joniska kanaler av excitativa membran 1 . Sedan dess har patch clamping applicerats på studien av många olika ämnen på cellulär, synaptisk och kretsnivå – både in vitro och in vivo – i många olika celltyper, inklusive neuroner, kardiomyocyter, Xenopus-oocyter och artificiella liposomer 2 . Denna process innefattar korrekt identifiering och inriktning av en cell av intresse, invecklad mikromanipulatorkontroll för att flytta patchpipetten i närheten av cellen, appliceringen av positivt och negativt tryck till pipetten vid rätt tidpunkt för att etablera en tät gigasplåster, Och ett inbrott för att upprätta en helcells patch-konfiguration. Patchklämning utförs typiskt manuellt och kräver omfattande träning för att behärska. Även för en forskare som har erfarenhet av plåstretKlämma är framgångsgraden relativt låg. Mer nyligen har flera försök gjorts för att automatisera patch-clamp-experiment. Två huvudstrategier har utvecklats för att åstadkomma automatisering: förstärkning av standard patch clamp utrustning för automatisk kontroll av patchprocessen och utformning av ny utrustning och tekniker från grunden. Den tidigare strategin är anpassningsbar till befintlig hårdvara och kan användas i en mängd olika patch-klämapplikationer, inklusive in vivo blindplastklemma 3 , 4 , 5 , in vitro patchklämma av akuta hjärnskivor, organotypa skivkulturer och odlade dissocierade neuroner 6 . Det möjliggör förhör av komplexa lokala kretsar genom att samtidigt använda flera mikromomanipulatorer 7 . Den plana patchmetoden är ett exempel på den nya utvecklingsstrategin, som kan uppnå den höga genomströmningen samtidigt pAtch clamp av celler i suspension för läkemedelsskärmningsändamål 8 . Den plana patchmetoden är dock inte tillämplig på alla celltyper, särskilt neuroner med långa processer eller intakta kretsar som innehåller omfattande anslutningar. Detta begränsar dess tillämpning för att kartlägga den invecklade kretsloppet i nervsystemet, vilket är en viktig fördel med traditionell patch clamp-teknik.
Vi har utvecklat ett system som automatiserar den manuella patch clamp processen in vitro genom att förstärka standard patch clamp hårdvara. Vårt system, Autopatcher IG, tillhandahåller automatisk pipettkalibrering, identifiering av fluorescerande celler, automatisk styrning av pipettrörelse, automatisk helcellsplåtering och dataloggning. Systemet kan automatiskt förvärva flera bilder av hjärnskivor på olika djup; Analysera dem med hjälp av datorsyn Och extrahera information, inklusive koordinaterna för fluorescensmärkta celler. Denna information kan då varaAnvänds för att rikta in och automatiskt patchera celler av intresse. Programvaran är skriven i Python-ett fritt språkprogram med öppen källkod, med flera bibliotek med öppen källkod. Detta säkerställer dess tillgänglighet till andra forskare och förbättrar reproducerbarheten och rigoriteten i elektrofysiologiska experiment. Systemet har en modulär design, så att extra maskinvara enkelt kan kopplas till det nuvarande systemet som visas här.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för automatiska bildstyrda patch clampinspelningar in vitro . Nyckelstegen i denna process sammanfattas enligt följande. Först användes datorvision för att automatiskt känna igen pipettspetsen med hjälp av en serie bilder som förvärvats via ett mikroskop. Denna information används sedan för att beräkna koordinatomvandlingsfunktionen mellan mikroskopet och manipulatorkoordinatsystemen. Datorsyn används för att automatiskt detektera fluorescensmärkta celler och identifier…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för det ekonomiska stödet från Whitehall Foundation. Vi vill tacka Samuel T. Kissinger för de värdefulla kommentarerna.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
