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Biochimie

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Published: July 28, 2017
doi:
10.3791/56011
, , ,
1Department of Biology,KU Leuven

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Abstract

As proteínas de ligação ao ARN (RBPs) determinam o destino dos ARNs. Eles participam de todas as vias de biogênese de RNA e contribuem especialmente para a regulação de genes pós-transcrição (PTGR) de ARNs mensageiros (mRNAs). Nos últimos anos, uma série de proteomas ligados a mRNA de leveduras e linhas de células de mamíferos foram isoladas com sucesso através do uso de um novo método chamado "captura de intercepto de ARNm", que permite a identificação de proteínas de ligação de mRNA (mRBPs) Diretamente de um ambiente fisiológico. O método é composto de reticulação ultravioleta (UV) in vivo , pull-down e purificação de complexos de ribonucleoproteína messenger (mRNPs) por esferas de oligo (dT) e a posterior identificação das proteínas reticuladas por espectrometria de massa (MS). Muito recentemente, ao aplicar o mesmo método, vários proteomas ligados a mRNA de plantas foram relatados simultaneamente em diferentes fontes de tecido de Arabidopsis : mudas etioladas, tecido foliar,Protoplastos de mesofila foliar e células de raízes cultivadas. Aqui, apresentamos o método otimizado de captura de interome de mRNA para protoplastos de mesofila de folha de Arabidopsis thaliana , um tipo de célula que serve como uma ferramenta versátil para experiências que incluem vários ensaios celulares. As condições para o rendimento proteico ideal incluem a quantidade de tecido inicial e a duração da irradiação UV. No proteoma ligado a mRNA obtido a partir de uma experiência de média escala (10 células 7 ), as RBPs observaram que a capacidade de ligação de RNA foi representada de forma exagerada e foram identificadas várias novas RBPs. O experimento pode ser ampliado (10 9 células), e o método otimizado pode ser aplicado a outros tipos e espécies de células vegetais para isolar, catalogar e comparar geneticamente proteinas de mRNA nas plantas.

Introduction

Os eucariotas usam múltiplos caminhos regulatórios da biogênese do ARN para manter os processos biológicos celulares. Entre os tipos conhecidos de ARN, o ARNm é muito diverso e traz a capacidade de codificação das proteínas e suas isoformas 1. A via PTGR direciona o destino dos pré-mRNAs 2 , 3 . RBPs de diferentes famílias de genes controlam a regulação do RNA, e em PTGR, mRBPs específicos orientam os mRNAs através de interações físicas diretas, formando mRNPs funcionais. Portanto, identificar e caracterizar mRBPs e seus mRNPs é fundamental para a compreensão da regulação do metabolismo do mRNA celular 2. Nas últimas três décadas, vários métodos in vitro – incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética de RNA (REMSA), evolução sistemática de ligandos por ensaios exponenciais de enriquecimento (SELEX) com base em construções derivadas da biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcados ou quantitativosEnsaios de ligação de ARN de fluorescência, cristalografia de raios X e espectroscopia de RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – foram amplamente aplicados a estudos de RBPs, principalmente de células de mamífero. Os resultados desses estudos de RBPs de mamíferos podem ser pesquisados ​​através da Base de Proteínas de Proteção de RNA (RBPDB), que coleta as observações publicadas 10 .

Embora essas abordagens in vitro sejam ferramentas poderosas, elas determinam os motivos de RNA vinculados a partir de um conjunto de sequências de RNA dado e, portanto, são limitadas na capacidade de descobrir novos RNAs alvo. O mesmo é verdade para estratégias computacionais para prever RBPs em todo o genoma, que se baseiam na conservação da seqüência e estrutura da proteína 15 . Para superar isso, um novo método experimental haFoi estabelecido que permite a identificação dos motivos RNA de que um RBP de interesse interage, bem como para a determinação da localização precisa da ligação. Este método, denominado "reticulação e imunoprecipitação" (CLIP), é composto de reticulação UV in vivo seguida de imunoprecipitação 11 . Estudos iniciais mostraram que a fotoativação de nucleotídeos de DNA e RNA pode ocorrer em comprimentos de onda ultravioleta de excitação superiores a 245 nm. A reacção através da timidina parece ser favorecida (classificação por ordem de redução da fotoreactividade: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Usando luz UV com um comprimento de onda de 254 nm (UV-C), observou-se que as ligações covalentes entre os nucleotídeos de ARN e os resíduos de proteínas são criados quando na faixa de apenas alguns Angstroms (Å). O fenômeno é, portanto, chamado de reticulação "zero-length" de RNA e RBP. Isto pode ser seguido por um rigoroso processo de purificação Com poucos antecedentes 13 , 14 .

Uma estratégia complementar ao CLIP é combinar reticulação UV in vivo com identificação de proteína para descrever a paisagem de RBPs. Vários desses proteomas ligados a ARNm do genoma foram isolados a partir de células de levedura, células-tronco embrionárias (ESC) e linhas celulares humanas ( ou seja, HEK293 e HeLa) utilizando esta nova abordagem experimental, chamada "captura de intercepto de mRNA" 18 , 19 , 20 , 21 . O método é composto de reticulação ultravioleta in vivo seguido por purificação de mRNP e proteômica baseada em MS. Ao aplicar esta estratégia, descobriram-se muitas RBPs "nítidas" que contêm RBDs não-canônicas, e tornou-se claro que mais proteínas possuem capacidades de ligação ao ARN do que se supunha anteriormente"> 15 , 16 , 17. O uso deste método permite novas aplicações e a capacidade de responder a novas questões biológicas ao investigar RBPs. Por exemplo, um estudo recente investigou a conservação do proteoma vinculado ao mRNA (RBP do núcleo) Proteoma) entre leveduras e células humanas 22 .

Os RBPs da planta já foram encontrados envolvidos no crescimento e no desenvolvimento ( por exemplo , na regulação pós-transcrição do tempo de floração, no relógio circadiano e na expressão gênica nas mitocôndrias e cloroplastos) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Além disso, eles são pensados ​​para desempenhar funções nos processos celulares que respondem a estresses abióticos ( por exemplo, frio, seca, saLinidade e ácido abscísico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Existem mais de 200 genes de RBP previstos no genoma de Arabidopsis thaliana , com base em motivos de reconhecimento de RNA (RRM) e homologia de K (KH); Em arroz, aproximadamente 250 foram observados 35 , 36 . É notável que muitas RBPs preditas parecem ser únicas para as plantas ( por exemplo, nenhum orthologs metazoários para aproximadamente 50% das RBPs Arabidopsis previstas contendo um domínio RRM) 35 , sugerindo que muitos podem servir novas funções. As funções das RBPs mais preditas permanecem não caracterizadas 23 .

O isolamento de proteomas ligados a mRNA de mudas etioladas de Arabidopsis , tecido foliar, células radiculares cultivadas e protoplastos de mesofila foliar através do uso deA captura de intercepto de mRNA foi recentemente relatada 38 , 39 . Esses estudos demonstram o forte potencial de catalogação sistemática de RBPs funcionais em plantas em um futuro próximo. Aqui, apresentamos um protocolo para captura de intereleto de mRNA a partir de protoplastos de plantas ( isto é, células sem paredes celulares). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana são o principal tipo de célula foliar. Os protoplastos isolados permitem o acesso ideal da luz UV às células. Este tipo de célula pode ser usado em ensaios que expressam transitoriamente proteínas para caracterização funcional 40 , 41 . Além disso, o protoplasting foi aplicado a vários outros tipos de células vegetais e espécies 42 , 43 , 44 ( eg, Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; e Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> O método abrange um total de 11 passos ( Figura 1A ). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são primeiro isolados (passo 1) e subsequentemente são irradiados com UV para formar mRNPs reticulados (passo 2). Quando os protoplastos são lisados ​​em condições de desnaturação (passo 3), as mRNP reticuladas são liberadas em tampão de lise / ligação e puxadas pelas pérolas oligo-d (T) 25 (passo 4). Após várias rodadas de lavagens rigorosas, os mRNPs são purificados e analisados ​​posteriormente. Os péptidos desnaturados de mRBPs são digeridos pela proteinase K antes dos mRNAs reticulados serem purificados e a qualidade do RNA é verificada por qRT-PCR (passos 5 e 6). Após o tratamento com RNase e a concentração de proteína (passo 7), a qualidade da proteína é controlada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) e coloração com prata (passo 8). A diferença nos padrões de banda proteica pode ser facilmente visualizada entre uma amostra reticulada (CL) e uma amostra não reticulada (não CL;A amostra de controle negativo de protoplastos que não está sujeita a irradiação UV). A identificação de proteínas é conseguida através de proteômica baseada em MS. As proteínas da amostra de CL são separadas por electroforese em gel de poliacrilamida unidimensional (1D-PAGE) para remover a possível contaminação de fundo, são "digeridas em gel" em péptidos curtos usando tripsina e são purificadas (passo 9). A cromatografia líquida nano de fase inversa acoplada à espectrometria de massa (nano-LC-MS) permite a determinação da quantidade de proteínas definitivas no proteoma ligado ao mRNA (passo 10). Finalmente, os mRBP identificados são caracterizados e catalogados usando a análise bioinformática (etapa 11).

Protocol

1. Aislamento de Protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis NOTA: Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são essencialmente isolados como descrito por Yoo et al ., 2007, com várias modificações 40 . Crescimento de plantas Mergulhe cerca de 200 sementes de etiópia Col-0 de Arabidopsis thaliana em água esterilizada durante 2 dias a 4 ° C na escuridão para estratificação…

Representative Results

Observamos um halo característico, que envolve o grânulo do talão na amostra CL, no passo de lavagem 4.3 com o tampão de lavagem 2 ( Figura 1B ). Embora não tenha sido investigado, esse fenômeno provavelmente pode ser explicado pela interferência de complexos de mRNP reticulados com agregação de grânulos durante a captura magnética, fazendo com que um agregado mais difuso se forme. Isso indica que a captura de pérolas oligo-d (T) 25 fo…

Discussion

Nós aplicamos com sucesso a captura de interome de mRNA, desenvolvida para leveduras e células humanas, para plantar protoplastos de mesofila foliar. As células do mesofílio da folha são o principal tipo de tecido moído nas folhas das plantas. A principal vantagem deste método é que ele usa reticulação in vivo para descobrir as proteínas de um ambiente fisiológico.

Neste protocolo, apresentamos principalmente uma série de condições experimentais otimizadas ( por e…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos o laboratório do Prof. Joris Winderickx, que forneceu o aparelho de reticulação UV equipado com a lâmpada UV convencional. A KG é apoiada pelo fundo de pesquisa KU Leuven e reconhece o apoio da subvenção FWO G065713N.

Materials

REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		 Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		 Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)		 Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1M LiCl
(Lithium Chloride)		 Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		 Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1M DTT
(Dithiothreitol)		 Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2		 307866 Lysis/binding buffer,
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical		 167620010 &
H/1200/PB15		 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1X PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		 Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		 S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 		 Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)		 Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)		 Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)		 Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)		 Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)		 MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)		 UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)		 SANKYO
DENKI		 SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)		 New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)		 EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		 STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)		 Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)		 Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)		 Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)		 Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)		 Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number Comments
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		 Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		 Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
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Keywords: MRNA InteractomeMRNA-bound ProteomePlant ProtoplastsPost-transcriptional Gene RegulationUV CrosslinkingArabidopsis ThalianaLeaf Mesophyll ProtoplastsMMG SolutionCentrifugation
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Citer Cet Article
Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).
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