Summary
Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi, şiddetli depresyon için en etkili tedavi deneysel hayvan bir modeldir. ECS düşük mortalite ve nöronal ölüm ile jeneralize Tonik klonik nöbetler neden olmaktadır ve ekran anti-epileptik ilaçlar için yaygın olarak kullanılan bir model. Burada, bir ECS indüksiyon yöntemi açıklamak hangi kısa bir 55-mA akım 0,5 için teslim edilir içinde s erkek için 200-250 g ağırlığında kulak-küçük elektrotlar aracılığıyla sıçanlar. Üretilen bu tür ikili stimülasyon sahne yaklaşık 10 süren 4-5 klonik nöbetler s. Akut veya kronik ECS bırakma sonra en rats davranışsal ayırt olmak kurtarıldı "nöbet" fareler sham. ECS genel olarak beyin aktivitesini yükseltir çünkü da faaliyet bağlı değişiklikler sinaptik proteinlerin ve sinaptik gücü birden çok yöntem kullanarak üzerindeki etkileri incelemek için kullanılmıştır. Özellikle, bu özel sinaptik yapısı, sinaptik proteinlerin bereket kantitatif tayin postsinaptik yoğunluğu (PSD), Western Blot birlikte hücre altı ayırma sağlar. Kemirgen beyin büyük miktarda gerektiren bir önceki ayırma yöntemi aksine, biz burada Sükroz degrade Santrifüjü olmadan tek bir sıçan hippocampi dan PSD yalıtmak için küçük ölçekli ayırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, biz izole PSD kesir postsinaptik membran proteinlerinin, PSD95, GluN2B ve GluA2 de dahil olmak üzere içerir gösterir. Presynaptic işaretçisi synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin başarılı PSD yalıtım gösteren PSD kesir dışlandı. Ayrıca, kronik ECS GluN2B ifade bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi genetik, farmakolojik veya mekanik tedaviler sonra Hipokampal PSD proteinler tek bir sıçan gelen değişiklikleri algılamak için uygulanabilir olduğunu belirten PSD olarak azalmıştır .
Introduction
Elektrokonvulsif terapi ağır ilaca dirençli depresyon, bipolar depresyon, Parkinson hastalıkları ve şizofreni1,2de dahil olmak üzere büyük depresif bozuklukların tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır. Bu terapi, nöbet elektrik uyarıcı epicranial elektrotlar1,2,3üzerinden imzalat hastalar başkanı teslim tarafından oluşturulur. ECS tekrarlayan yönetimini ilaca dirençli depresif bozukluklar1,2,3' e klinik olarak yararlı olmuştur. Ancak, uzun vadede etkinlik insanlarda antidepresan etkisi altında yatan kesin mekanizması zor kalmıştır. ECS Elektrokonvulsif terapi hayvan bir modeldir ve tedavi onun mekanizma araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Rodents, akut ECS ve kronik ECS tedavi hippocampi yetişkin neurogenesis teşvik ve hangi bilişsel esneklik ilerleme-e doğru katkıda bulunmak olasıdır neural ağ4,5, yeniden düzenleyebilirsiniz. Ayrıca, beyin aktivitesi ECS tarafından küresel yükselmesine Tutanaklar, bolluk değiştirir gibi bir beyin neurotropic faktörü6ve metabotropic Glutamat reseptör 17 ve N-metil-D-aspartat dahil olmak üzere birden fazla protein elde (NMDA) tipi Glutamat reseptör alt birimleri7. Bu değişiklikler synapse numarası, yapısı ve Hipokampus7,8,9gücü uzun vadeli modifikasyonu arabuluculuk katılmaktadırlar.
ECS modellerinde, elektriksel stimülasyon jeneralize Tonik klonik nöbetler10,11uyandırmak için Stereotaxic implante elektrotlar, kornea elektrotlar veya kulak elektrotlar yoluyla kemirgenler teslim edilir. Elektrot stereotaksik implantasyon beyin ameliyatı içerir ve deneyci'nın yaralanma en aza indirmek için cerrahi becerilerini geliştirmek için önemli ölçüde zaman gerektirir. Daha az invaziv kornea elektrotlar kornea aşınma ve kuruluk neden olabilir ve anestezi gerektirir. Çünkü onlar kemirgen cerrahi ve anestezi olmadan kullanılabilir ve en az yaralanmalara neden kulak-küçük elektrotlar kullanımı bu sınırlamalar atlar. Gerçekten de, geçerli uyanık teslim fareler ile kulak-küçük elektrotlar güvenilir sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler neden olmaktadır ve onların hippocampi10sinaptik proteinler değiştirir bulduk.
Kemirgenler belirli beyin bölgelerinde sinaptik proteinlerin ECS kaynaklı bereket incelemek için kendi algılama ve miktar için en uygun deneysel yöntemleri seçmek önemlidir. Beyin hücre altı ayırma çözünür sitozolik protein ham yalıtımı için sağlar; zar proteinleri; Organel sınırları proteinler; ve proteinler PSD12,13,14gibi özel hücre altı yapıları arasında bile. PSD bir yoğun ve iyi organize edilmiş hücre altı sinaptik proteinler ve postsinaptik membran12,13,15yakınındaki yüksek konsantrasyonlu nöronlar malıdır. Yalıtım PSD PSD bereket ve postsinaptik Glutamat reseptörlerinin, iskele proteinler ve sinyal iletim proteinler PSD12 fonksiyon dinamik değişiklikleri beri zenginleştirilmiş sinaptik proteinlerin çalışma için yararlıdır , 15 , 16 , 17 sinaptik plastisite ve çeşitli nörolojik bozukluklar17,18içinde gözlenen synaptopathy ile ilişkili mısınız. Önceki hücre altı ayırma yöntemi PSD arındırmak için kullanılır beyin ham membran kısmını dan deterjan çözünmez kesir yalıtım tarafından Sükroz degradeler14, aralıklarla fark dahil. 19. o kemirgen büyük miktarlarda beyin14,19istemek bu geleneksel yöntemle büyük sorun olduğunu. PSD kesir tedavi başına izole etmek için 10-20 kemirgenler hazırlanması geniş maliyet ve zaman yatırım gerektirir ve birçok tedavi ise pratik olarak mümkün değildir.
Bu zorluğu aşmak için biz doğrudan olmadan Sükroz degrade Santrifüjü20,21, PSD kesir yalıtır ve PSD yalıtım için uygun tek bir sıçan hippocampi revize daha basit bir yöntem adapte olması beyin. Bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi hakkında verimleri 30-50 µg 2 hippocampi, immunoprecipitation ve Western Blot de dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal testleri kullanmak için yeterli dan PSD proteinlerin. Western Blot PSD zenginleştirme (PSD-95) postsinaptik yoğunluğu protein 95 ve presynaptic işaret synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin dışlanması ifşa tarafından izole için bizim yöntem başarısını gösterir. Bizim ECS indüksiyon ve küçük ölçekli PSD ayırma yöntemleri diğer kemirgen beyin bölgelerine kolayca uyarlanabilir ve PSD proteinlerin ifade ECS etkilerini değerlendirmek için nispeten basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvanlar bakım ve kullanım komite toplantısında Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. bir sıçan koloni Bakımı
- (Bkz. Tablo reçetesi) Sprague-Dawley Rat doğurmak ve 12-h koyu döngüsü ve gıda ve su ad libitum erişim ile standart koşullarda proje.
- Fare pups postnatal gününde (P) 28 vazgeçirmek ve 2-4 erkek veya kadın littermates gruplar halinde onları evi.
- Erkek rats kuyruk toksik olmayan kalıcı bir siyah kalem tanımlama için WITH mark.
- Haftada 3 kez erkek rats tartmak ve onların bodyweights kaydedin.
2. bir ECS makine hazırlanması
- 07:30 at hayvan Hazırlık odasında tezgah dezenfekte ve bankta bir ECS makine (pulse jeneratörü) yerleştirin.
- Bir kapak ile temiz, boş bir kafeste 200-250 g ağırlığında bir bireysel erkek fare yerleştirin. ECS indüksiyon ile tedavi olmak tüm erkek rats için bu işlemi yineleyin. İzin vermek için 30 dk alıştırmak rats.
- Fareler onların kafeslerde habituating iken, bir darbe jeneratör ECS indüksiyon için 100 bakliyat/s, bir darbe genişliği 0.5 MS, bir şok süresi 0,5 frekansı ayarla s ve 55 mevcut mA (şekil 1A).
- Darbe üreteci hazır olun "RESET" düğmesine basıyorum ve "Hazır" düğmenin ışığı yanar sağlanması. Kulak klipleri bir darbe jeneratör bağlı değil ve sonra bir kaç saniye için "Şok" düğmesine emin olun.
Not: Bu noktada, nabız jeneratör ECS indüksiyon için hazırdır. - Kulak klipleri darbe jeneratör takın.
3. akut ECS indüksiyon
Not: Bkz. Resim 1B, üst panel.
- Kulak klipler steril serum fizyolojik ile ıslak ve onlar doygun emin olun.
- Ne dedikleri kulakları ile steril serum fizyolojik serum batırılmış gazlı bez içinde sarma tarafından ıslak. Sonra onları ıslak gazlı bez çıkarın.
- Kulak, ana kıkırdak grubun ötesinde pozisyon başına bir küçük resim ekleyin.
- ECS makinede doğru bir döngü kurulur onaylamak; Eğer değilse, bir hata iletisi veya bir okuma "1"-ecek gözükmek üstünde belgili tanımlık makine.
- Kalın, metal olmayan bir eldiven giymek. Fareyi yavaşça eldivenli elinde tutarken, bir kaç saniye için "Şok" düğmesine ve yavaş yavaş nöbet gözlemlemek için fare üzerinde kavrama bırakın. Sham "nöbet" için (NS) kontrol fare aynı şekilde başa ama geçerli teslim etme.
- Clonus başlar gibi kulak klipleri çıkarın ve "ağız ve yüz hareketleri" içerir "başını sallayarak (Aşama 1), kafa" (Aşama 2), "forelimb clonus" gözden geçirilmiş bir Racine'in ölçek22 göre nöbet davranış kayıt (evre 3), "yetiştirme forelimb clonus ile" (4 kademe) ve "yetiştirme ve forelimb clonus ile düşen" (sahne 5). Nöbet yaklaşık 10 sürmelidir s; kayıt zamanlayıcı kullanarak nöbet süresi.
- Nöbet fesih, fare için ev onun kafes dönmek. Fareyi fare kurtarma nöbetler en emin olmak başka bir 5 min için izleyin. Onu kafeste tek başına yer tutmak ve kafes kurtarma odasına dönün.
- Sonraki fare üzerinde ECS indüksiyon yineleyin.
- Fareler kalan gün ve sabahları en az bir kez ve bir kez onlar are euthanized için deneyler kadar ertesi gün öğleden sonra boyunca izlemek.
Not: ECS indüksiyon yöntemi bir olası yan dikkat gerektiren etki olarak, klinik belirtiler için neden olabilir. Örneğin, ECS indüksiyon Protokolü 15 s ve neden gereksiz sıkıntı fareler için daha uzun ömürlü nöbetlere neden. Bu durumda, diazepam (10 mg/kg, IP) veya Fentobarbital (25-30 mg/kg, IP) kullanarak alma işlemini sonlandırın. Fareler solunum güçlüğü veya şiddetli davranış anormallikleri nöbet bırakma takip geliştirirseniz, onları işten çıkarma tarafından takip karbon dioksit Solunduğunda ötenazi.
4. kronik ECS indüksiyon
Not: Resim 1B, alt paneli bakın.
- Günlük sabah yedi gün üst üste adımlarda 1-3, yukarıda açıklandığı gibi aynı zamanda bir ECS neden.
- Fareler iki kez bir gün sonra evlerine iade kafesleri monitör.
5. homojenizasyon ve sıçan Hippocampi ayırma
Not: Şekil 2bakın.
- 320 mM Sükroz, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, içeren bir taze homojenizasyon arabelleği (a çözüm) hazırlamak 200 nM okadaic asit ve proteaz inhibitörleri. Filtreleri bir 0,22 µm gözenek boyutu ile vakum filtrasyonu için kullanarak arabellek filtre sterilize et ve buz üzerinde yerleştirin.
- Belirli bir zamanda ECS akut veya kronik ECS (şekil 1) aşağıdaki noktası, 5-10 dk, bir Giyotin kullanarak işten çıkarma tarafından takip için CO2 Solunduğunda sıçan ötenazi.
- Beyin kaldırmak ve hippocampi buzda,23,24daha önce açıklandığı gibi yerleştirilen metal plaka üzerinde incelemek.
- 30 mm doku kültürü üzerine bir sıçan gelen yer iki hippocampi çanağı ve onları küçük parçalara makas kullanarak kıyma.
- Kıyılmış hippocampi 1 mL pipet kullanarak bir Manuel cam homogenizer aktarmak ve buz gibi homojenizasyon arabellek (çözüm A, adım 5.1) 1 mL ekleyin. Yuvarlak bir havaneli ile cam homogenizer yerleştirin. Cam homogenizer buz üzerinde olmakla birlikte, kadar küçük parçalar halinde Hipokampal doku ortadan yavaşça ve sürekli yukarı ve aşağı 1 dk. için 10 - 15 kez havaneli üzerinde inme.
- 1-mL pipet kullanarak 1.7 mL microcentrifuge tüp homogenate aktarmak ve çözünmez doku ve hücre çekirdeği (P1 kesir) içeren Pelet homogenate vasıl 800 x g 4 ° C'de postnuclear süpernatant (S1 kesir) ayırmak için 10 dk santrifüj kapasitesi. 1 mL pipet kullanarak iki ayrı, yeni 1.7 mL microcentrifuge tüpler 50 µL ve S1 fraksiyonunun 950 µL aktarın ve bu tüpler buza depolayın. P1 kesir Pelet buza kaydedin.
- S1 kesir (950 µL) 13,800 x g ve çözünür sitozolik protein ile zenginleştirilmiş süpernatant (S2 kesir), ayırmak için 4 ° C de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet (P2 kesir), synaptosomal proteinler de dahil olmak üzere membran bağlı proteinler ile zenginleştirilmiş. 1-mL pipet kullanarak yeni bir 1,7 mL microcentrifuge S2 kesir aktarın ve buza depolayın.
- Pelet (P2 kesir) 1-mL pipet kullanarak buz gibi arıtılmış su 498 µL içinde resuspend. 1 M HEPES (pH 7,4) 2 µL eklemek 4 mM HEPES (pH 7,4) son bir konsantrasyon ulaşmak için 20 µL pipet kullanarak. 30 dk. deposu için ajitasyon ile 4 ° C'de resuspended P2 kesir buz üzerinde kuluçkaya.
- BCA tahlil kullanarak S1, S2 ve P2 kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 50 mM HEPES (pH 7,4) 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak için her kesir ekleyin veya PSD yalıtmak için P2 kesir işlemek.
6. yalıtım PSD gelen ham membran proteini (P2) kesir
- 25.000 x g ve 4 ° C 20 dk P2 kesir (500 µL) santrifüj kapasitesi lysed süpernatant (LS2 kesir) ve lysed Pelet (LP1 kesir) ayırmak için. LS2 kesir 1 mL pipet kullanarak bir yeni 1.7 mL microcentrifuge tüp için aktarın ve buza depolayın.
- LP1 Pelet 250 µL % 1 deterjan 1 x 1 mL pipet kullanarak PBS arabellek ile karışık 250 µL 50 mm HEPES (pH 7,4) resuspend. 15 dakika nazik ajitasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.
- Resuspended LP1 Pelet 25.000 x g ve süpernatant (PSD kesir) Pelet (PSD kesir) ayırmak için 4 ° C'de 3 h için santrifüj kapasitesi. 1.7-mL microcentrifuge Tube süpernatant kaldırmak ve PSD Pelet 50 mM HEPES (pH 7,4) 100 µL içinde resuspend 200 µL pipet kullanarak.
- LS2, Sigara-PSD ve BCA tahlil kullanarak PSD kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 50 mM HEPES (pH 7,4) 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak için her kesir ekleyin.
Not: tüm çözümler adım 5-6 (Yani, çözüm A, HEPES tampon ve PBS arabellek) kullanılan arıtılmış su iyonik ve organik kirleticiler ve parçacıklar ücretsiz ile yapılmalıdır.
7. Batı kurutma
- Her protein fraksiyonu buz çözme. Her kesir (S2, P2 ve PSD 1 mg/ml) 12 µL 20 µL pipet kullanarak bir yeni 1.7 mL microcentrifuge tüp için transfer.
- 5 x SDS örnek arabelleği 3 µL ekleyin ve 75 ° c 30 dk içinde bir su banyosu için kuluçkaya. Örnek oda sıcaklığında (RT) aşağı ne yapıyorsun?
- Protein örneği 10 µL % 4-20 degrade 15-iyi tarak SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) jel 20 µL pipet kullanarak her kuyunun içine yükleyin. SDS-sayfa aparatı ve arabellek çalışan 80-100 V jel çalıştırmak (25 mM Tris, 190 mM glisin ve % 0.1 SDS; pH 8.3).
Not: Her jel protein örnekleri NS fareler ve ECS rats akut veya kronik ECS takip farklı zaman noktalarda içermelidir. - Proteinler SDS sayfasından jel transfer polivinil difluoride (PVDF) membran içinde 25-30 V, aktarım cihazları (60 mA) için 9-12 h aktarma arabelleği (25 mM Tris, 190 mM glisin ve % 20 metanol; pH 8.3).
- PVDF membran aktarım cihazları kaldır ve RT. çok amaçlı rotator üzerinde 5 min için Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) yıkayın
- Membran % 5 süt engellemek ve % 0.1 ara-20 TBS 1 h. için kuluçkaya bu birincil antikor (Tablo 1) çamaşır arabellek içinde (% 1 süt ve % 0.1 ara-20 TBS) gecede 4 ° C çok amaçlı rotator üzerinde (dilutions için Malzemeler tablo bakınız).
- Membran 10 min için 4 kez yıkama arabellekte yıkayın ve ardından horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Birleşik arabellek için 1S RT. çok amaçlı rotator yıkama içinde ikincil antikorlar
- Membran 10 min için 4 kez yıkama yıkama arabellek ve sonra TBS ile 5 min için.
- Membran ile 1 min için geliştirilmiş chemifluorescence substrat kuluçkaya ve röntgen filmi ile maruz kalmaktadır. Film işlemciye sahip maruz filmi banyo.
8. Batı lekesi miktar
- İnceden inceye gözden geçirmek Western blot TIFF dosyası olarak ve bu dosyayı bilgisayarınıza kaydedin.
- "Dosya," "Açık resim," sağ ok "gri ölçekli." altında gri tonlamalı bir görüntüyü olarak ImageJ programda Western blot dosya açmak
- ImageJ araç çubuğundan dikdörtgen seçim aracı seçin ve bir tek Western blot grup ilgi bir proteinin kapsar bir dikdörtgen çizin.
- "Analiz" altında "alan ve seçilen bir grubun ortalama yoğunluğu elde etmek için ölçü birimi" vurmak.
- Dikdörtgenin boyutunu ve şeklini değiştirmeden bir arka plan alanına taşıyın. 8.4 alan ve bir arka plan ortalama yoğunluğu arasındaki adımları yineleyin.
- Ortalama yoğunluk değeri, bir arka plan grubu bu bir Western blot orkestra'arka plan düşülen grup yoğunluk ilgi protein veren çıkarma.
- İlgi için tüm Western blot bantlarında 8.2 8.6 adımları yineleyin.
- Protein ilgi grubu arka plan düşülen yoğunluğu α-tübülin gibi bir temizlik gen ürünü arka plan düşülen grup yoğunluğu tarafından bölmek; Bu adım faiz protein normalleştirilmiş değerini verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ayrıntılı yordam kullanılarak sunulan burada, bir elektrik çarpması (55 anne, 0,5 için 100 bakliyat/s s) kulak-küçük elektrotlar indüklenen yinelenmeyen sahne ile 4-5 Tonik-klonik nöbetler içinde rats (şekil 1A-B) teslim. Toplam 8 sıçan akut ECS indüksiyon alınan ve sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler görüntülenir. Nöbetler hakkında 10 sürdü s ve 1-2 dk içinde nöbet bırakma kurtarılan tüm rats. Sahte "yok nöbet" fareler bir elektrik çarpması almadı ve bu nedenle nöbetler göstermedi. Toplam 4 sham sıçan kullanılmıştır. Kronik ECS indüksiyon için fareler 7 gün üst üste için günde bir elektrik şok geçirdi ve sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler üzerine her elektrik çarpması (şekil 1A-B) görüntülenir. Toplam 8 sıçan kronik ECS indüksiyon alınan ve toplam 4 sham sıçan "nöbet" rats aynı derecede kullanılmıştır. Kronik ECS alınan en rats davranışsal ayırt edilemez olmasına rağmen gelen sham "nöbet" fareler, birkaç gelişmiş vücut titreme ve keşif amaçlı etkinliği 7inci elektrik çarpması ile düşük.
ECS kaynaklı etkinlik küresel yükselmesine hippocampi ifadede protein değiştirirse incelemek için fareler 3 h ve 24 h akut ECS sonra ve 24 h ve 96 h son ECS kronik ECS tedavisinde (şekil 1B) sonra kurban edildi. İki hippocampi her fare üzerinden hızla disseke ve bizim en iyi duruma getirilmiş küçük ölçekli Ayırma Protokolü (Şekil 2) tabi. İki hippocampi çözünmez doku ve hücre çekirdeği (S1 kesir) ücretsiz ilk homogenate 13,800 x g ham membran Pelet içeren gelen çözünür sitoplazmik protein (S2 kesir) içeren süpernatant ayırmak 10 min için de yeniden centrifuged yapıldı. synaptosomes (P2 kesir) (Şekil 2). Bizim Western blot sitoplazmik protein α-tübülin algılandı gösteren başarılı ayırma, akut ve kronik ECS ile (şekil 3 ve şekil 4), tedavi fareler üzerinden hippocampi, S2 kesirler, ama P2 kesirler, sitozolik çözünür protein ham membran topakları üzerinden.
PSD95 membran ilişkili guanilat kinaz (MAGUK) ailesinin bir üyesini PSD12,18,25temel bileşenlerinden biridir. PSD95 ve NMDA reseptör alt birim GluN2B sadece P2 kesirler, ama değil S2 kesirler (şekil 3 ve şekil 4) tespit edildi. Bir başka bir glutamatergic α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptör alt birimi GluA2 daha güçlü ifade hippocampi (şekil 3 ve şekil 4), S2 kesirler göre P2 kesirler algılandı postsinaptik membran proteinlerinin ham membran P2 kesir granül zenginleştirilmiş gösteren. İlginçtir, sinaptik vezikül protein synaptophysin ve integral membran protein Striatal zenginleştirilmiş tirozin fosfataz 61 (adım61)26 eşit S2 ve P2 kesirler (şekil 3 ve şekil 4) tespit edildi. Sinaptik veziküller küçük boyutu göz önüne alındığında-39 nm27 ve endosomes ortalama bir çapı ile ham membran Pelet (P2 kesir) yalıtmak için aralıklarla tüm sinaptik veziküller ve endosomes cips için yeterli olmayabilir. Bu sonuçlar birlikte bizim ham Ayırma Protokolü membran bağlı proteinler ve sinaptik veziküller ve muhtemelen endosomes ham membran P2 kesir ile ilişkili olmayan transmembran proteinler zenginleştirebilirsiniz gösterir.
ECS kaynaklı etkinlik küresel yükselmesine ifade hippocampi postsinaptik proteinlerin değiştirirse incelemek için ham membran P2 kesir buz gibi suda lysed, HEPES tampon resuspended ve izole etmek 20 dk için 25.000 x g, centrifuged lysed Pelet (LP1) (Şekil 2). LP1 Pelet HEPES tampon % 1 Triton X-100 deterjan içeren resuspended ve de 25.000 x g 3 h PSD Pelet (Şekil 2) elde etmek için üzerinden centrifuged. PSD95, GluN2B ve GluA2 PSD kesirler sonraki Western blot tespit (şekil 3 ve şekil 4), hangi postsinaptik proteinler17,25,28bilinmektedir. Ancak, PSD kesirler α-tübülin yoktu ve daha da önemlisi, presynaptic işaret synaptophysin (şekil 3 ve şekil 4). GluN2B ve GluA2 dephosphorylates ve Elçilerin işleri onların negatif regülatör29,30,31, adım61, PSD kesirler (şekil 3 ve şekil 4) bulunamadı ADIM61PSD26yılında zenginleştirilmiş PSD95 tarafından aracılı, sinaptik dışlanması gösteren son raporu ile tutarlı. Özet olarak, bu sonuçlar bizim küçük ölçekli ayırma yöntemi başarıyla PSD protein ham membran P2 kesir dan izole gösterir.
GluN2B ifade P2 kesir değiştirilmemiş ama artan bir eğilim PSD kesir 3 h ve 24 saat sonra akut ECS görüntülenen Western Blot miktar saptandı (n = 4) (şekil 3B). GluA2 ifade P2 ve PSD kesirler 3 h ve 24 h akut ECS (şekil 3C) takip değiştirilmedi. 24 h ve kronik ECS sonra 96 h, GluN2B ifade azalan bir eğilim P2 kesir görüntülenen ve PSD kesir azaltılacağını (24 h p < 0,05, n 4; 48 h p = < 0,01, n = 4) (şekil 4B). Buna ek olarak, kronik ECS GluA2 ifade P2 ve PSD kesirler etkilemedi (n = 4) (şekil 4C).
Resim 1 : Akut ECS ve kronik ECS indüksiyon için şema. (A) A fare darbe jeneratör kulak-küçük elektrotlar ve bir elektrik çarpması ile bağlanmıştır (55 anne, 0,5 için 100 bakliyat/s s) sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler temin için uygulandı. (B) Akut ECS tarafından bir elektrik çarpması akımıdır. Kronik ECS 7 gün üst üste için günde bir elektrik çarpması tarafından elde edildi. Gösterilen zaman Puan ECS akut veya kronik ECS indüksiyon diseksiyon hippocampi önce için son ECS indüksiyon takip süresi temsil eder. "Nöbet" sham (NS) kontrol fareler aynı şekilde ele ama did değil almak bir elektrik çarpması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İş akışını S2, P2 ve PSD kesirler tek bir sıçan Hippocampi dan izole etmek için hücre altı ayırma ve. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Muayene sinaptik proteinler Hipokampal S2, P2 ve fareler bu alınan NS veya akut ECS dan PSD kesirler. (a) temsilcisi Batı açıkları göster NMDA reseptör alt birim GluN2B, AMPA reseptör GluA2 ve adım61 protein ifadesi S2, P2, ve PSD kesirler sahte "(NS) fareler ve bu sıçanlar yok nöbet" hippocampi üzerinden alınan akut ECS. Çözünür sitoplazmik protein α-tübülin S2 kesir zenginleştirilmiştir. Synaptophysin bir presynaptic vezikül protein ve ham membran P2 kesir ama PSD kesir zenginleştirilmiştir. PSD-95 P2 ve PSD kesirler zenginleştirilmiştir. (B-C) GluN2B miktar (B) ve GluA2 (C) 3 ve 24 sonra akut ECS s P2 ve PSD kesirler (n = 4 fareler her zaman noktası). GluN2B ve GluA2 ifade P2 kesir α-tübülin S2 kesir için normalleştirilmiş. GluN2B ve GluA2 ifade PSD kesir PSD-95'e PSD kesir normalleştirilmiş. Verileri sunulmaktadır yüzde ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Muayene sinaptik proteinler Hipokampal S2, P2 ve fareler bu alınan NS veya kronik ECS dan PSD kesirler. Temsilcisi Western α-tübülin çöplerinizi; synaptophysin; ADIM61; ve postsinaptik proteinler, PSD95, GluN2B ve GluA2, sahte "(NS) fareler ve bu sıçanlar yok nöbet" hippocampi üzerinden S2, P2 ve PSD kesirler gibi kronik ECS aldı. Çözünür sitoplazmik protein α-tübülin S2 kesir zenginleştirilmiştir. Synaptophysin bir presynaptic vezikül protein ve ham membran P2 kesir ama PSD kesir zenginleştirilmiştir. PSD-95 P2 ve PSD kesirler zenginleştirilmiştir. (B-C) GluN2B miktar (B) ve GluA2 (C) 24 ve 96 sonra kronik ECS s P2 ve PSD kesirler (n = 4 fareler her zaman noktası). GluN2B ve GluA2 ifade P2 kesir α-tübülin S2 kesir için normalleştirilmiş. GluN2B ve GluA2 ifade PSD kesir PSD-95'e PSD kesir normalleştirilmiş. Verileri yüzde ± SEM sunulur; * p < 0,05, ** p < 0,01 denetim (ANOVA ve Tukey'nın post-hoc testi) ile karşılaştırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kesir | Protein fraksiyonu | Protein marker |
| P1 | Nükleer | Histon H1 |
| S1 | Sitozol/membrances | a-tübülin (sitoiskeleti) ve GAPDH (sitozol) |
| P2 | Ham synaptosomes | AMPA ve NMDA reseptör alt birimleri |
| S2 | Sitozol/ışık membrances | GAPDH (sitozol) ve LAMP1 (lysosome) |
| Synaptosomal membran | Synaptosome/mitokondri | AMPA ve NMDAR reseptör alt birimleri, Synaptophysin (presynaptic işareti) |
| PSD | PSD | AMPA ve NMDA reseptör alt birimleri, PSD95, PICK1, CaMKII |
Tablo 1: Liste-in Protein işaretleri ve antikorlar hücre altı kesirleri ayırmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, biz onların hippocampi nöronal aktivite küresel uyarılması ortaya çıkarır bir ECS indüksiyon yöntemi Sıçanlarda açıklayın. ECS Elektrokonvulsif terapi, klinik olarak insanlar1,2,3' te uyuşturucu ateşe dayanıklı depresif bozuklukların tedavisinde kullanılır hayvan bir modeldir. Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon tedavisi için kullanılmasına rağmen kesin altta yatan mekanizma belirsizdir. ECS depressant-gibi davranışları Rodents indükler ve Hipokampal neurogenesis4,32uyarır çünkü ECS kapsamlı yeni araştırmak için kullanılmıştır yetişkin tarihi nöronlarda hipokampüs dentat gyrus anti-depresan davranış5,32' ye katkıda bulunur.
ECS Rodents Stereotaxic implante elektrotlar, kornea elektrotlar veya kulak-küçük elektrotlar33,34aracılığıyla geçerli teslimat üzerine hafif şiddetli jeneralize Tonik klonik nöbetler neden olmaktadır. Hastalarda EEG kayıtları daha tek taraflı stimülasyon35,36ikili elektriksel stimülasyon daha belirgin ve daha uzun jeneralize nöbetler neden olduğunu ortaya çıkardı. Bizim ECS indüksiyon yöntemi, Tonik-klonik nöbet nöbet bilateral stimülasyon36tarafından uyarılmış insanlarda taklit eden her iki kulak bağlı invaziv olmayan kulak-küçük elektrotlar aracılığıyla geçerli teslimatın tarafından indüklenir. ECS etkinliği için sedasyon veya anestezi uygulandığı Sıçanlarda kontrol etmediğim, anestezik ilaçlar için fareler veren olabilir elektriksel stimülasyon tarafından indüklenen nöbetler derecesini azaltabilecek mümkün olsa da aslında bu nedeniyle Anestezi devlet fizyolojik beyin ağ gelişmiş inhibitör ve nemlendirilmiş eksitatör sesi ile ilişkilidir. Ayrıca, kritik ECS indüksiyon yöntemi deneysel sahne 4-5 temin için geçerli yoğunluğu çevirmek için yaş, ağırlık ve kemirgen türleri dayalı Tonik - klonik bir nöbet Genelleştirilmiş adımdır. Bizim ECS indüksiyon yöntemi uyanık erkek Sprague-Dawley Rat 200-250 g ağırlığında bir kaç saniye içinde sahne 4-5 nöbetler inducing için optimize edilmiştir. Anestezi devlet altında fareler ECS indüksiyon için kullandıysanız, şiddeti, süresi ve sıklığı geçerli teslim başarılı indüksiyon aşamasından 4-5 arasında değişen-nöbet için değiştirilmesi gerekir.
ECS da hiperaktivite nöronlar içinde uyarıcı ve çok düşük mortalite33, Pilokarpin ve kainit, durum Epileptikus teşvik ve neden dahil olmak üzere chemoconvulsants, aksine ile akut geçici nöbetler neden avantajı sunuyor tekrarlayan spontan nöbetler ve şiddetli histolojik değişiklikler37,38kronik tezahürüdür. ECS rutin için ekran anti-epileptik ilaçların33,34kullanılmıştır rağmen akut ECS ve kronik ECS kronik epilepsi üretimi neden değil ve böylece bir hayvan modelinde epileptogenesis çalışmak için kullanılamaz. Bunun yerine, ECS yaygın olduğu ifade ve/veya sinaptik proteinler vivo içindesinaptik kalıcı değişikliklere katkıda ardından değişiklikler beyin aktivitesi geniş yükselmesine değiştirir ölçüde incelemek için istihdam edilmiştir (güç ve yapılarışekil 3 ve şekil 4)10,40. Bu çalışmada, biz sadece erkek rats estrus beklenmeyen etkileri PSD protein miktarına dişi rats döngüsü aşamasını ECS sonra dışlamak için kullanılır. Ancak, PSD-95 ve SAP102 frontal korteks ve Hipokampus39hormonal değişiklikler estrus döngüsü yöneten Bazal etkilemeyebilir ima, PSD bölgesinde de dahil olmak üzere iskele proteinlerde hiç seks fark yoktur gözlenmiştir PSD protein miktarı.
Birden çok yöntem için ECS neurogenesis, synaptogenesis ve sinaptik plastisite5,6,7,8,9, değişiklikler indükler ölçüde incelemek için istihdam edilmiştir 11 , 40. eksitatör postsinaptik akım (EPSC) Elektrofizyolojik kayıtlar yaygın olarak glutamatergic eksitatör sinaptik gücü değişimler synapses21algılamak için kullanılır. Örneğin, minyatür EPSC kayıtları akut ECS41takip farelerin II-III katmanların kortikal piramidal nöronların eksitatör sinaptik gücü homeostatik downscaling ortaya çıkardı. Ancak, ECS kaynaklı sinaptik plastisite katkıda sinaptik proteinler Elektrofizyolojik kayıtlar genetik nakavt ile eşleştirilmelidir çünkü zorlu veya knock-down belirli aday sinaptik proteinlerin tanımlamasıdır. Postsinaptik membran ve sinaptik proteinler PSD zenginleştirilmiş Glutamat reseptörlerinin düzeyi değişiklikleri güç ve etkinlik eksitatör sinaptik iletimi17,18,25düzenler. İmmünhistokimya ECS kaynaklı sinaptik proteinlerin ifade değişimler incelemek için kullanılabilmesine rağmen bu teknik sadece 1-2 aday sinaptik proteinler teker teker inceleyebilirsiniz ve özellikle onları tanımak iyi doğrulanmış antikorlar gerektirir non-spesifik boyama neden olmadan.
Hücre altı ayırma, Western Blot birlikte beyin dokusunun Elektrofizyoloji ve immünhistokimya ECS tarafından değiştirilmiş sinaptik proteinlerin belirlenmesinde avantaj sunar. Beyin dokusu hücre altı ayırma ER ve Golgi membranlar, membran bağlı organelleri, plazma membran, dahil olmak üzere çözünür sitozolik protein (S2 kesir) ham membranlar (P2 kesir), dan ayırmak için bir hızlı ve ham biyokimyasal bir yöntemdir ve form synaptosomes42' ye,43,44yeniden mühürlemek sinaptik terminal membranlar. PSD kesir-ebilmek var olmak daha fazla sinaptik proteinler42,43,44zenginleştirmek için P2 kesir izole. PSD kesir tarafsız proteomik analizini olan düzeyleri ECS tarafından değiştirilmiş tüm PSD proteinler teşhis edebilir. Western Blot hızla belirsiz bantları kolayca tanımlanabilir PSD proteinlerin ifade değişiklikleri incelemek için gerçekleştirilebilir.
Beyin ayırma önceki yöntemi bu tekniği kullanmak için zorlu incelerken çözünür hale kemirgen beyin doku42,43,44, veya membran proteinlerinin bir birey üzerinden büyük miktarda gerektirir kemirgen beyin ya da tek bir beyin belirli beyin bölgesinden. Kantitatif Proteom bir beyin bölgesinden diğerine ve bir denetim hayvandan transgenik bir hayvan ya da belirli bir tedavi uğramıştır bir hayvan için karşılaştırmak için artan bir talep var. Bu nedenle, biz gözden geçirilmiş ve geleneksel beyin ayırma yöntemi tek bir farenin iki hippocampi üzerinden ham çözünür ve membran kesirler yalıtmak için en iyi duruma getirilmiş. Bizim küçük ölçekli ham Ayırma Protokolü başarıyla membran bağlı PSD95 olarak algılandı, ancak sitoplazmik protein α-tübülin P2 kesirler eksikliği gösterildiği gibi ham P2 membran kesirler sitozolik S2 çözünür kesirler, gelen izole P2 ama değil S2 kesirler (şekil 3A ve şekil 4A). Burada açıklanan yöntemi kullanarak, biz kantitatif akut ECS önemli ölçüde adım61 ifade artırır ve tirozin fosforilasyon, onun yüzeylerde, GluN2B ve ekstraselüler sinyal düzenlenir kinaz 1/2 ham içinde azaltır göstermiştir fare hippocampi, 48 h akut ECS10takip membran P2 kısmını.
Beklenmedik bir şekilde, S2 kesirler synaptophysin yer alan; ADIM61; ve çok daha az bir ölçüde, GluA2 (şekil 3A ve şekil 4A). ADIM61 endoplazmik retikulum (ER) ve PSD45ile ilişkili bir glikozile integral membran protein26 yaşında. Santrifüjü ham membran Pelet (P2 kesir) izole etmek için synaptosomes yanı sıra endosomes içeren tüm sinaptik veziküller cips için yeterli olmayabilir ve GluA2 ve adım61içeren organellerin mümkündür. Yine de, GluN2B, GluA2 ve PSD95 zenginleştirme temizleyin ve α-tübülin P2 kesirler eksikliği göstermek bizim Ayırma Protokolü membran bağlı proteinler ve sinaptik veziküller ile ilişkili olmayan transmembran proteinler zenginleştirmek ve endosomes ham membran P2 kesir.
Ham membran P2 kesir synaptosomes içerse de, bir muayene etkinlik bağlı değişiklikler P2 kesir sinaptik proteinlerin yaptıkları değişiklikleri tam yerini tespit edilemez kısıtlamasıdır. Sinaptik proteinler PSD zenginleştirilmiş belirlenecek olsaydı, daha fazla biyokimyasal ayırma PSD yalıtmak için kullanılabilir. PSD ayırma önceki yöntemi kemirgen beyin dokusu büyük miktarda gerektirir (yani, 10-20 kemirgen beyin) ve sukroz degradeler42,43,44. Bu geleneksel yöntem tek bir farenin iki hippocampi dan PSD kesir yeterli miktarda yalıtmak yetersiz olduğu için doğrudan bir Sükroz degrade20,21 olmadan PSD kesir izole a sade yöntem adapte olması . Bu yöntem hakkında verimleri 30-50 µg PSD proteinin Western Blot de dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal deneyleri için yeterli. Bizim yöntemi PSD95, GluN2B ve GluA2, PSD kesir konsantre için bilinen zenginleştiren ve kronik ECS indüksiyon (şekil 3 ve şekil 4) takip PSD kesir GluN2B ifadede değişiklikleri algılar.
Burada, bizim nicel Western blot analizi 3 h ve 24 h akut ECS (şekil 3C) takip P2 ve PSD kesirler ifadede GluA2 önemli bir değişiklik ortaya koydu. GluN2B ifade P2 kesir değiştirilmemiş ama sonra akut ECS (şekil 3B), sinaptik extrasynaptic karşı olası farklı düzenleme düşündüren artan bir eğilim 3 h ve 24 h PSD kesir görüntülenen NMDA reseptörleri GluN2B içeren. Biz de GluN2B ifade azalan bir eğilim P2 kesir kronik ECS sonra görüntülenen ve PSD kesir 24 ve 96 h kronik ECS (şekil 4B) takip önemli ölçüde azalmıştır gözlenen. Rağmen son derece spekülatif, böyle kaldırılması GluN2B ECS tekrarlayan indüksiyon takip PSD üzerinden doğrudan PSD membran veya lateral Difüzyon extrasynaptic sitelere içselleştirilmesi dahil olmak üzere birden çok mekanizmaları tarafından aracılık. Bizim önceki rapor o uzun süreli geliştirme nöronal aktivite belirgin göz önünde bulundurarak adım61 ifade artırır ve bizim bulgular öneririz kültürlü Hipokampal nöronlar46, P2 kesirler Tyr-fosforilasyon, GluN2B azaltır GluN2B ifade P2 ve kronik ECS olasılığı nedeniyle olabilir sonra PSD kesirler bir azalma adım61 ifade ve GluN2B sonraki kaldırma extrasynaptic membran gelen gelişmiş.
Özetle, biz bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi bir ECS indüksiyon protokolü ile birlikte bize vivo ayırt etmek için etkinlik bağlı yönetmelik Glutamat reseptörlerinin postsinaptik membran sağlayan göstermiştir Toplam plazma membran karşı extrasynaptic membranlar dahil olmak üzere. Bu iletişim kuralı kolayca herhangi bir sinaptik proteinler eksitatör sinapslarda, uygulanabilir ve diğer kemirgen hippocampi veya diğer beyin bölgeleri için doku ağırlığını dayalı her çözüm sesini tarafından değiştirilebilir. Böylece, bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi çok yönlü ve her hayvanın genetik, farmakolojik veya mekanik tedavi üzerine postsinaptik proteinler vivo içinde değişiklikleri incelemek gelecekteki uygulamalar için kabul edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Dr. Eric C. Bolton onun santrifüj ayırma ve Dr. Graham H. Diering için bize PSD ayırma için küçük ölçekli kuralıyla sağlamak için John Hopkins Üniversitesi'nde Dr. Richard L. Huganir'ın laboratuarında kullanmak izin verdiğiniz için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
