Intra-splénique Transplantation d’hépatocytes après hépatectomie partielle en clin de œil. Souris SCID
Summary
Nous avons décrit un protocole permettant d’effectuer une hépatectomie partielle (PHx) et la transplantation de cellules par l’intermédiaire de rate en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris. Dans ce protocole, une incision est faite pour exposer et résection du lobe gauche du foie suivi d’une autre incision pour la transplantation intra-splénique de cellules.
Abstract
Une hépatectomie partielle est une méthode polyvalente et reproductible pour étudier la régénération du foie et l’effet de la thérapeutique de la cellule en fonction dans diverses conditions pathologiques. Une hépatectomie partielle facilite également l’augmentation de prise de greffe et la prolifération des cellules transplantées en accélérant la néovascularisation et la migration des cellules vers le foie. Nous décrivons ici un protocole simple pour effectuer une hépatectomie 30 % et la transplantation de cellules dans la rate d’un diabétique/sévère non obèses combinées NOD immunodéficients. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris.
Dans cette procédure, deux petites incisions sont pratiquées. La première incision est d’exposer et de résection du lobe gauche du foie, et une autre petite incision est faite pour exposer la rate pour la transplantation intra-splénique de cellules. Cette procédure ne nécessite pas des compétences chirurgicales spécialisées, et il peut être complété en 5-7 minutes avec moins de stress et douleurs, une récupération plus rapide et meilleure survie. Nous avons démontré la transplantation des hépatocytes isolés d’une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant des souris (transgéniques C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), mais aussi des hépatocytes comme des cellules d’origine humaine (NeoHep) en partiellement hépatectomisés clin de œil. Souris SCID.
Introduction
Actuellement, la transplantation hépatocytaire est proposée comme une alternative à la transplantation d’organes entiers pour le traitement des patients ayant des troubles hépatiques graves. On croit qu’il peut combler les patients de transplantation organes entiers1. En plus de l’allogreffe hépatocytes2, hépatocytes xénogène3 et dérivées de cellules souches4 les hépatocytes sont également étudiés dans des modèles animaux. Dans ce contexte, la domiciliation et la greffe le potentiel des cellules transplantées chez le receveur est un critère important pour la thérapie cellulaire basé dans l’insuffisance hépatique aiguë (AHF).
Pour enquêter sur la transplantation d’hépatocytes ou cellules semblables à des hépatocytes5, AHF est créée dans un modèle animal par chirurgie6 ou pharmacologiques7 procédures, suivies par la transplantation de cellules. Pour faire un modèle animal de l’AHF de réactifs pharmacologiques, nombreux hépatotoxines comme d-galactosamine8, acétaminophène9, tétrachlorure de carbone10, thioacétamide11, concanavaline A12, lipopolysaccharide13 , etc.., ont été utilisés. Dans cette liste, chaque réactif génère un ensemble unique de fonctionnalités pour AHF, mais malheureusement aucun réactif unique n’imite l’AHF humaine. En outre, l’AHF induite par les hépatotoxines prend beaucoup de temps, ce qui place les animaux sous stress chronique, et des résultats reproductibles sont difficiles à obtenir.
En revanche, l’intervention chirurgicale d’une hépatectomie partielle (PHx) est dépendante de compétence, et des résultats reproductibles sont faciles à obtenir après avoir développé les compétences requises. Pour provoquer l’AHF par elle seule une intervention chirurgicale, la résection de plus de 70 % du foie est nécessaire ; Toutefois, moins d’une hépatectomie 70 % peut encore servir pour étudier la prise de greffe et la prolifération des transplanté des cellules du foie pour analyser leur capacité thérapeutique lors de lésions du foie14. La transplantation des hépatocytes ont été exécutées après hépatectomie par le péritoine15, queue veine16,17de la veine hépatique ou la rate18. Actuellement, la perfusion veineuse hépatique et la transplantation intra-splénique des hépatocytes sont les procédures privilégiées, car ils sont plus faciles à reproduire.
Dans cet article, nous avons décrit une procédure pour une hépatectomie partielle de 30 % en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris dont le lobe gauche du foie est excisé. Il est suivi par la transplantation de 0,2 millions hépatocytes de souris (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) exprimant GFP ainsi que leur origine humaine NeoHep19 dans la rate. Cette procédure conduit à la prise de la greffe des cellules transplantées dans le foie. Cette procédure est la moins invasive et une technique peu douloureuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une hépatectomie partielle est une technique établie pour la régénération du foie chargée de l’enquête, et une hépatectomie excessive est signalée à imiter le modèle de l’AHF. Parmi les modèles animaux de l’AHF, rongeurs, en particulier des souris, sont le modèle plus étudié. Pour obtenir un modèle de lésions hépatiques chez les souris, jusqu’à une hépatectomie 70 % ont été signalés avec une bonne survie taux25,26. Cependant en nu et …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention de base provenance du département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde à l’Institut National d’immunologie, New Delhi. Adresse actuelle de m. Bhattacharjee est Division de gastro-entérologie, hépatologie et Nutrition, Hospital de Los Angeles pour enfants.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase’s analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure?. Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- . . Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
