Summary

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Published: September 13, 2017
doi:

Summary

Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.

Abstract

Doença cardíaca é a principal causa de morte humana no mundo. Numerosos estudos têm demonstrado forte ligação entre obesidade e mau funcionamento cardíaco em humanos, mas mais ferramentas e esforços de pesquisa são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Para mais de um século, o modelo geneticamente altamente tratável de Drosophila tem sido fundamental na descoberta de genes-chave e vias moleculares que provou ser altamente conservadas em toda a espécie. Muitos processos biológicos e mecanismos de doença são funcionalmente conservados na mosca, como desenvolvimento (por exemplo, plano de corpo, coração), câncer e doenças neurodegenerativas. Recentemente, o estudo da obesidade e patologias secundárias, tais como doença em organismos-modelo, tem desempenhado um papel altamente crítico na identificação dos principais reguladores envolvidos na síndrome metabólica em seres humanos.

Aqui, propomos usar esse organismo modelo como uma ferramenta eficiente para induzir a obesidade, ou seja, acumulação excessiva de gordura e desenvolver um protocolo eficiente para monitorar o teor de gordura sob a forma de acumulação de TAGs. Além de altamente conservadas, mas menos complexo genoma, a mosca também tem uma vida curta para a experimentação rápida, combinada com a relação custo-eficácia. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a alimentação de alta gordura dieta (HFD) em Drosophila para induzir a obesidade e um ensaio de triacilglicerol (TAG) de alto rendimento para medir o associado aumento no teor de gordura, com o objectivo de ser altamente reprodutível e eficiente para rastreio genético ou químico em larga escala. Estes protocolos oferecem novas oportunidades para eficientemente investigar mecanismos reguladores envolvidos na obesidade, bem como fornecer uma plataforma padronizada para a pesquisa de descoberta de drogas para testes rápidos do efeito de candidatos da droga sobre o desenvolvimento ou prevenção da obesidade, diabetes e doenças metabólicas associadas.

Introduction

Estamos em um tempo onde a obesidade e seus associados encargos económicos, é um problema mundial1. Dois em cada três americanos estão com sobrepeso ou obesos com patologias do coração relacionadas, a principal causa de morte dentro da população adulta2. Novos métodos eficientes são necessários para investigar adequadamente os componentes genéticos e moleculares implicados na regulação da síndrome metabólica, usando organismos modelo. Por esta razão, nós escolhemos o mosca de fruta Drosophila modelo porque ele compartilha os processos biológicos mais básicos com mamíferos, incluindo ratos e seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaé altamente conservadas durante a evolução, mas no geral é muito menor com menos duplicação de genes e complexidade metabólica, tornando-a ideal para compreender os mecanismos fundamentais implicados em muitas doenças humanas4 , 7 , 8. Além disso, característico de processos realizados pelo tecido adiposo, intestino e pâncreas são representados na mosca e mediar funções reguladoras no metabolismo glicose e lipídios, por exemplo, que são semelhantes aos seres humanos9, 10,11. Além disso, as vias moleculares básicas envolvidos no controle da obesidade, resistência à insulina e diabetes em seres humanos são funcionalmente conservadas em Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tem um coração que é formado durante o desenvolvimento de processos semelhantes do coração dos mamíferos3,17. Assim, o desenvolvimento de um confiável HFD alimentação protocolo e ensaio de TAG alto throughput, adaptado para fins de triagem eficiente usando a caixa de ferramenta genética da Drosophila, fornecem um meio importante para estudar e entender a base genética fundamental doenças metabólicas complexas subjacentes.

O próprio alimento HFD é feito a partir de um alimento mosca de laboratório padrão suplementado com óleo de coco, que é composto principalmente de ácidos graxos saturados, conhecidos por ser associado com a síndrome metabólica18. Enquanto induzir obesidade em modelos de mamíferos, como roedores, pode levar meses19,20, nosso HFD otimizado protocolo de alimentação em Drosophila eficazmente e reproducibly aumenta a gordura em questão de dias12,14. Este protocolo, em conjunto com um ensaio de alto throughput TAG, permite eficiente triagem em massa para os efeitos de fatores genéticos, influências ambientais e candidatos a fármacos para descobrir novos moduladores do metabolismo das gorduras. Em consequência, estes protocolos são prováveis relevantes para entender e/ou combater a obesidade e patologias humanas associadas a obesidade.

O protocolo de alimentação é versátil e pode ser aplicado para estudar os efeitos metabólicos e funcionais do único de ácidos gordos saturados ou insaturados. O uso deste teste de TAG de alta taxa de transferência não está limitado a d. melanogaster, mas pode ser adaptado a uma variedade de organismos modelo pequeno com cutícula ou matrizes extracelulares duros (por exemplo, outras espécies de Drosophila , c. elegans e outros emergentes organismos invertebrados modelo) para medir o teor de gordura em diferentes condições ambientais, genéticas ou fisiológicas, em qualquer fase de desenvolvimento, maturidade ou fase da doença metabólica. O ensaio de TAG é baseado em uma medição colorimétrica de uma série de reações enzimáticas que degradam as TAGs em ácidos graxos livres, glicerol, o glicerol-3-fosfato e finalmente H2O2 , que reage com 4-aminoantipyrine (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (3,5 DHBS) para produzir um produto de cor vermelho que é medido utilizando um Espectrofotômetro de 96 poços.

Protocol

1. HFD alimentação protocolo tabela 1. Receita de comida de mosca. Esta tabela resume os diferentes ingredientes usados para preparar nosso controle alimentar. Uma vez feita, 10 mL do alimento é vertido em frascos, refrigerado e estocado a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. Preparação HFD para fazer 1 kg de alimento gordo alto, pesa 700 g de comida de…

Representative Results

No d. melanogaster, como é o caso com outras espécies, existe dimorfismo sexual entre machos e fêmeas,22. É sabido que as fêmeas são maiores, com mais gordura em seus abdomens, do que os machos22. Para testar a eficácia do nosso protocolo, realizamos ensaios de TAG para determinar as diferenças de conteúdo da marca entre machos e fêmeas de sua padrão de laboratório (w1118) voa. Os dados mostram que as…

Discussion

Indução de obesidade em ratos pode levar meses19,20. Nas moscas, este HFD alimentando o protocolo permite a indução de acúmulo de gordura em excesso em questão de dias ou menos, causando aumentos no acúmulo de gordura somente após 18 h (ver Figura 2). HFD alimentando com o protocolo descrito aumenta o conteúdo de glicose 12 e Bmm lipase e PGC-1 expressão24. Isto está…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Erika Taylor para edição deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por subvenções provenientes do National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) de R.B., um suplemento de investigação pós-doutoramento (R01 HL085481) e companheirismo (AAUW) para S.B.D., concessões e da associação americana do coração para S.B.D. e RGB

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

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Citer Cet Article
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

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