Xenopus में CRISPR/Cas9-आधारित Leapfrogging के लिए मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण
Summary
अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन उत्परिवर्ती लाइनों बनाने के लिए तकनीकी बाधाओं मुद्रा । Leapfrogging मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण के साथ जीनोम संपादन के संयोजन के लिए जंगली प्रकार germline उत्परिवर्तनों ले जाने जानवरों बनाने के द्वारा घातकता को दरकिनार । Leapfrogging F1 जनरेशन में homozygous null म्यूटेंट की कुशल पीढ़ी को भी परमिट देता है । यहां ट्रांसप्लांटेशन स्टेप का प्रदर्शन किया जाता है ।
Abstract
जीनोम संपादन द्वारा उत्परिवर्ती लाइनों के निर्माण के कई जीवों में आनुवंशिक विश्लेषण में तेजी लाने है । CRISPR/Cas9 तरीकों अफ्रीकी पंजे मेंढक, Xenopus, जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक पुराना मॉडल जीव में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है । CRISPR/Cas9-लक्षित mutagenesis के साथ homozygous उत्परिवर्ती लाइनों को बनाने के लिए पारंपरिक प्रजनन योजनाएं कई बार लेने वाली और श्रमसाध्य कदम हैं । उत्परिवर्ती भ्रूण के निर्माण की सुविधा के लिए, विशेष रूप से जीन है कि embryogenesis के लिए आवश्यक है दस्तक के साथ जुड़े बाधाओं को दूर करने के लिए, एक नई leapfrogging बुलाया विधि विकसित की गई थी । इस तकनीक को Xenopus भ्रूण की मजबूती leverages “कट और पेस्ट” embryological तरीकों । Leapfrogging कुशलता से मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) के हस्तांतरण का इस्तेमाल-mutagenized दाता भ्रूण PGC-ablated wildtype भाई बहनों में । इस विधि wildtype दैहिक कोशिकाओं है कि एक उत्परिवर्ती germline ले के साथ chimeric जानवरों बनाने के द्वारा आवश्यक जीन के कुशल उत्परिवर्तन के लिए अनुमति देता है । जब दो च0 पशुओं “फायनान्शियल प्रत्यारोपण” ले (यानी, उत्परिवर्ती रोगाणु कोशिकाओं) परस्पर है, वे homozygous, या यौगिक heterozygous, नल एफ1 भ्रूण, इस प्रकार एक पूर्ण पीढ़ी के लिए phenotypic डेटा प्राप्त करने के समय की बचत का उत्पादन । Leapfrogging भी मातृ प्रभाव जीन का विश्लेषण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो एफ के लिए दुर्दम्य रहे है0 phenotypic विश्लेषण निंनलिखित CRISPR/Cas9 mutagenesis । इस पांडुलिपि विवरण leapfrogging की विधि, कैसे सफलतापूर्वक PGC ट्रांसप्लांटेशन प्रदर्शन करने पर विशेष जोर के साथ ।
Introduction
कैसे जीनोटाइप encodes phenotype जीव विज्ञान में एक प्रमुख सवाल है मेंडेल कानूनों की पुनर्खोज के बाद से किया गया है । जीन की भूमिकाओं की समझ, उनके विनियमन और जीन नेटवर्क के भीतर बातचीत, और इनकोडिंग उत्पादों के कार्यों के लिए नए जीव विज्ञान और उंनति रोग राज्यों को उजागर करने के लिए उपकरण प्रदान करने का वादा किया । आधे से अधिक एक सदी के लिए1, अफ्रीकी पंजे मेंढक, Xenopus, बुनियादी जीव विज्ञान और जैव चिकित्सा में विषयों की एक विस्तृत विविधता पर अध्ययन के लिए एक अग्रणी मॉडल, विकास के आनुवंशिक नियंत्रण सहित किया गया है । ऐतिहासिक, Xenopus पर सबसे अधिक शोध allotetraploid मेंढक, एक्स. laevisका इस्तेमाल किया है, लेकिन हाल ही में, इसके diploidy के कारण, एक्स tropicalis एक amphibian आनुवंशिक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । पूरा जीनोम दृश्यों दोनों Xenopus प्रजातियों2,3से इकट्ठा किया गया है । “मेंढक समुदाय” एक मोड़ पर अब है, जहां बुनियादी जीनोम संशोधन प्रौद्योगिकी जीन समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, वस्तुतः पर होगा । programme CRISPR/Cas9 endonucleases अत्यधिक कुशल जीन के mutagenesis बनाया है, biallelic के अधिकांश कोशिकाओं में संभव उत्परिवर्तन के साथ पशु4,5,6,7, 8,9,10,11. ये अध्ययन, भट्टाचार्य एट अल द्वारा रेखांकित किया । १२ आणि Shigeta एट अल. 13, पता चला है कि कई जीन के समारोह एफ0 मोज़ेक पशुओं में mutagenesis द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं; हालांकि, Cas9-sgRNA-microinjected भ्रूण अक्सर कार्य (LOF) के अपूर्ण हानि के कारण चर phenotypes प्रदर्शित करते हैं । अधिक महत्वपूर्ण है, उत्परिवर्ती लाइनों की पीढ़ी के कुछ अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक लाभप्रद है-विशेष रूप से जब जीन है कि एक मातृ mRNA योगदान है अध्ययन । मातृ mRNAs और प्रोटीन, और epigenetics पर उनके प्रभाव, embryogenesis14,15,16में एक विस्तारित अवधि के लिए जारी रहती है, कई जीन के प्रारंभिक विकासात्मक योगदान प्रदान दुर्दम्य च0 िरा. इसलिए, अंय LOF approaches आवश्यक हैं ।
जब उत्परिवर्ती लाइनों बनाने की मांग, homozygous LOF भ्रूण प्राप्त करने के लिए पथ कई बाधाओं है । सबसे पहले, कुशल mutagenesis biallelic उत्परिवर्तनों का उत्पादन करने के लिए वंचित किया जा सकता है क्योंकि आवश्यक जीन कार्यों के नुकसान के लिए यौन परिपक्वता के लिए जीवित रहने की विफलता में परिणाम, एक व्यवहार्य लाइन के उत्पादन के साथ हस्तक्षेप । एक आम समाधान है Cas9-sgRNA की राशि का सावधान अनुमापन दिया । यहां, लक्ष्य के लिए घातकता को कम करने के बीच एक संतुलन हासिल करते हुए भी germline mutagenesis दक्षता अधिकतम है । एक दूसरी समस्या मानक प्रजनन योजना से उत्पंन होती है, जहां phenotypic विश्लेषणों को एफ2 पीढ़ी तक आस्थगित किया जाता है । मानक दृष्टिकोण का उपयोग करना, यौन परिपक्व च0 पशुओं कि germline के माध्यम से उत्परिवर्ती alleles संचारित एफ1 heterozygous “वाहक” है, जो तो यौन परिपक्वता के लिए हो रहे है उत्पादन को पार कर रहे हैं । दो च1 heterozygotes तो 25% की उंमीद Mendelian आवृत्ति पर एफ2 उत्परिवर्ती भ्रूण उत्पादन पार कर रहे हैं । इस प्रकार, प्रजनन के दो पीढ़ियों उत्परिवर्ती phenotypes के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । उत्परिवर्ती जानवरों या तो homozygotes या यौगिक heterozygotes (यानी, दो अलग उत्परिवर्ती alleles, जो माता पिता के एफ1 परस्पर में इस्तेमाल किया जानवरों के पादी पर निर्भर करता है युक्त संतति) हो सकता है ।
इन बाधाओं रोगाणु कोशिकाओं है, जो leapfrogging17बुलाया एक नई विधि पर निर्भर को परिष्कृत प्रोग्राम nuclease-मध्यस्थता mutagenesis द्वारा दूर किया जा सकता है । Leapfrogging दो मुख्य घटक है: (1) कैस के microinjection sgRNA, या nuclease-sgRNA परिसरों के साथ एक साथ mRNA (या, सिद्धांत, TALENs या जस्ता फिंगर nucleases में) एकल सेल मंच पर कुशलतापूर्वक mutagenize भ्रूण जीनोम, द्वारा पीछा किया (2) wildtype सहोदर भ्रूण में PGCs के प्रत्यारोपण, जहां अंतर्जात PGCs हटा दिया गया । जब दोनों कदम कुशल हैं, उत्परिवर्ती रोगाणु कोशिकाओं के साथ पूरा germline प्रतिस्थापन प्राप्त किया जा सकता है । Blackler 1960 के दशक में है कि Xenopus PGCs देर neurula और जल्दी tailbud चरणों में भ्रूण के बीच प्रत्यारोपण किया जा सकता है प्रदर्शन18,19। leapfrogging के लिए, Blackler के दृष्टिकोण ब्लासटुला चरण17में प्रत्यारोपण प्रदर्शन द्वारा संशोधित किया गया था, जब PGCs भ्रूण20,21के वनस्पति पोल में स्थानीयकृत रहे हैं । ट्रांसप्लांटेशन से पहले gastrulation दो मुख्य लाभ है । पहला, प्रत्यारोपण के engraftment और बाद में सामान्य विकास के लिए और अधिक कुशल जब प्रत्यारोपण ब्लासटुला मंच (अप्रकाशित टिप्पणियों) पर किया जाता है पाया गया था । दूसरा, ब्लासटुला प्रदर्शन करके चरण प्रत्यारोपण शीघ्र ही zygotic प्रतिलेखन के बाद शुरू हो गया है, एक विकासात्मक जीन उत्परिवर्तनों से उत्पंन होने वाली घातकता से बचने कर सकते है कि gastrulation बाधित या कि अंयथा विकृत देर neurulae के लिए सीसा । PGC प्रत्यारोपण-असर (“leapfrogged”) भ्रूण यौन परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे हैं, और इन एफ के बीच परस्पर0 जानवरों का प्रदर्शन किया है कि, कई मामलों में, एफ1 संतति के १००% प्रदर्शन LOF phenotype (सबसे यौगिक जा रहा है heterozygotes), लक्षित उत्परिवर्तनों के साथ पूरा germline प्रतिस्थापन का संकेत है ।
उम्मीद की जा रही है कि leapfrogging Xenopusमें आनुवंशिक दृष्टिकोण में तेजी लाएगा । Leapfrogging भी मातृ प्रभाव जीन (अप्रकाशित टिप्पणियों) के LOF विश्लेषण के लिए “होस्ट स्थानांतरण” विधि22 के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। वर्तमान प्रकाशन में, विधि का विस्तृत वर्णन, विशेष रूप से PGC प्रत्यारोपण पर ध्यान केंद्रित करते हुए, x. tropicalis में प्रस्तुत किया गया है ( x. laevisके लिए छोटे संशोधनों के साथ) । PGCs के प्रत्यारोपण यहां का प्रदर्शन किया है इस प्रौद्योगिकी के अंय प्रयोगशालाओं के लिए एक और अधिक तेजी से हस्तांतरण की सुविधा के लिए Xenopusके साथ काम कर रहे । इस विधि के सिद्धांतों में सफल होना चाहिए अन्य उभयचर (जैसे, urodeles), और जीव-पद्धति में विशिष्ट संशोधनों के लिए आवेदन के लिए अनुमति देनी चाहिए कई अन्य जानवरों जिसमें कुशल mutagenesis पूरा किया जा सकता और PGCs आसानी से प्रत्यारोपण कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह रिपोर्ट PGCs युक्त वनस्पति ऊतक के प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. PGCs के प्रत्यारोपण के जीनोम के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है संपादन प्रौद्योगिकियों (जैसे, CRISPR/Cas9) ए…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य एवं मानव विकास संस्थान से अनुदान, 5R21HD080684-02 के सहयोग से किया गया । लेखक अपने सतत उत्साह और समर्थन के लिए केन चो शुक्रिया अदा करना चाहता है । लेखक भी अपने कैमरे के उपयोग के लिए ब्रूस ब्लमबर्ग स्वीकार करना चाहते हैं, रिबका Charney, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए, और शॉन McNamara और मार्सिन Wlizla राष्ट्रीय Xenopus संसाधन पर (RRID: SCR_013731), के लिए बहुमूल्य X. tropicalis खिला और पशु देखभाल परहेजों के बारे में बातचीत ।
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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